三棱UPLC-UV特征圖譜研究△

唐嵩媛，趙琦琦，孫暉*，閆廣利*，王喜軍，車延檸，張秀玲

1.黑龍江中醫(yī)藥大學/教育部經(jīng)典名方有效性評價及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱中藥四廠有限公司，黑龍江 哈爾濱 150500

三棱為黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoloniferumBuch.-Ham.的干燥塊莖，味辛、苦，性平，歸肝、脾二經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛的功效，用于癥瘕痞塊、痛經(jīng)、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛、食積脹痛[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)疏》記載：“三棱，從血藥則治血，從氣藥則治氣，能治一切凝結停滯之堅積也?！盵2]《醫(yī)學衷中參西錄》記載：“三棱、莪術為化瘀血之要藥，化血之力三棱優(yōu)于莪術，理氣之力莪術優(yōu)于三棱?！盵3]現(xiàn)代藥理研究表明，三棱具有抑制血小板聚集及抗血栓、抗動脈粥樣硬化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化等作用[4]。三棱的化學成分復雜，目前已分離鑒定的化合物主要包括苯丙素、有機酸、黃酮、甾體、蒽醌、生物堿、揮發(fā)油、二苯基庚烷、脂肪酸等類成分[5]。然而，三棱功效相關的藥效物質(zhì)基礎仍不明確，導致目前仍沒有建立有效的三棱質(zhì)量控制方法，《中華人民共和國藥典》2020 年版（一部）三棱藥材項下僅有性狀、顯微和薄層鑒別，無明確的成分定性、定量檢測標準[1]，難以保障其臨床療效。

由于三棱藥效物質(zhì)基礎不明確，對化學成分進行整體表征是控制其質(zhì)量的必要手段。指紋圖譜/特征圖譜是中藥整體質(zhì)量控制的有效方法，現(xiàn)已作為中藥注射劑[6]、中藥配方顆粒[7]、古代經(jīng)典名方復方制劑[8]、中藥創(chuàng)新藥[9]的質(zhì)量標準檢測項目，以及作為上市品種質(zhì)量標準提升和生產(chǎn)全過程質(zhì)量控制的重要研究內(nèi)容[10]。三棱的指紋圖譜已有報道[11-14]，然而其檢測的共有峰或特征峰均為香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、對香豆酸等極性有機酸類成分。該類成分雖然具有一定生物活性，但其在藥用植物中廣泛存在，仍需要增加三棱特征成分的檢測，以增強其專屬性和質(zhì)量控制的有效性。本研究系統(tǒng)考察色譜分離和紫外光譜檢測條件，建立能夠表征三棱藥材更多結構類型化學成分的特征圖譜，為三棱藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供新的方法。

1 材料

ACQUITY 型超高效液相色譜儀，配備光電二極管陣列（PDA）檢測器和Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）；AE-240 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300DA 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

色譜純乙腈（美國Fisher 公司）；色譜純磷酸[阿拉丁試劑（上海）有限公司]；色譜純甲醇（美國Dikma公司）；水為超純水；10批三棱藥材，產(chǎn)地為浙江磐安，批號分別為170101、170102、170103、170104、170105、170106、170107、170108、170109、1701010，均由哈爾濱中藥四廠有限公司提供；對照品咖啡酸（批號：11085-201703，純度：99.7%）、阿魏酸（批號：110773-201915，純度：99.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品對香豆酸（批號：21052604，純度：99.97%）購自成都普菲德生物技術有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～20%A；5～6 min，20%～35%A；6～10 min，35%A；10～12 min，35%～50%A；12～15 min，50%～75%A；15～16 min，75%～100%A）；檢測波長：0～12 min為300 nm，12～16 min為240 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.4 mL·min-1；進樣體積：3 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取三棱粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入75%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（頻率50 kHz，功率250 W），放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取對照品咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸適量，精密稱定，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.667、1.017、1.305 μg·mL-1的對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，考察色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果測得各共有峰相對保留時間的RSD 均小于1.0%，相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 精密稱定三棱粉末，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按2.1項下色譜條件進樣分析，考察色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于1.0%，相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱定三棱粉末，按2.2 項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12 h 后按2.1 項下色譜條件采集色譜圖，考察色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果測得各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD 均小于3.0%，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）計算，測得色譜指紋圖譜與其所得的共有模式圖的相似度均為1.000，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 特征圖譜的建立及相似度評價

取10 批三棱藥材樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件采集色譜圖，得10批三棱的超高效液相色譜-紫外法（UPLC-UV）圖譜。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）進行色譜峰匹配，選擇中位數(shù)法及多點校正法生成對照圖譜（圖1）。選擇色譜圖中分離度較好、峰強度適中的共有色譜峰作為特征峰，共標定11 個共有特征峰，按出峰時間依次標記為1～11號峰。峰4 經(jīng)對照品比對認定為對香豆酸，該峰峰面積適中，保留時間穩(wěn)定，以其作為參照峰（S），規(guī)定其他峰的相對保留時間：峰1 為0.42 min，峰2為0.77 min，峰3為0.95 min，峰4為1.00 min，峰5為1.07 min，峰6 為1.23 min，峰7 為1.52 min，峰8 為1.59 min，峰9 為1.63 min，峰10 為2.01 min，峰11 為2.64 min。計算各批三棱藥材特征圖譜與對照圖譜的相似度，結果表明，10 批三棱藥材特征圖譜的相似度分別為0.969、0.991、0.915、0.972、0.967、0.977、0.987、0.987、0.954、0.985，表明10批三棱藥材批次間穩(wěn)定性良好。

圖1 10批三棱藥材的UPLC-UV圖（S1～S10）及對照指紋圖譜（R）

2.6 特征峰認定

為考察特征圖譜是否具有代表性，通過對照品比對和質(zhì)譜解析的方法對三棱藥材主要特征峰進行認定。按照三棱藥材特征圖譜分析條件采集咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸的色譜圖，通過比較保留時間和紫外光譜圖，認定2號峰為咖啡酸，4號峰為對香豆酸，5號峰為阿魏酸，見圖2。

圖2 代表性三棱藥材UPLC-UV特征圖譜及混合對照品色譜圖

由于難以獲得其他三棱成分的對照品，本研究利用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q/TOF-MS）對上述三棱指紋圖譜的共有峰進行認定。色譜條件參照2.1 項，僅用甲酸代替磷酸，即0.1%甲酸水-乙腈作為流動相，其他參數(shù)相同。質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子源，負離子檢測模式下，毛細管電壓為2.5 kV；錐孔提取電壓為3.0 V；去溶劑氣溫度為350 ℃；去溶劑氣體積流量為700 L·h-1；錐孔氣體積流量為50 L·h-1；離子源溫度為110 ℃；相對分子質(zhì)量檢測范圍m/z50～1200。測得三棱藥材UPLC-Q/TOF-MS 總離子流色譜圖，與三棱UPLC-UV 指紋圖譜比較，根據(jù)相對保留時間確定總離子流色譜圖中對應的指紋圖譜共有峰，見圖3。由于峰1和峰3在總離子流色譜圖中峰強度較低，而且受其他峰干擾，不能進行認定。采集峰6～11的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息，利用一級質(zhì)譜圖提供的準分子離子精確質(zhì)量和同位素峰比例，計算分子式。在三棱藥材已知化學成分中匹配與該分子式一致的化合物，進一步通過解析二級質(zhì)譜的裂解途徑，對匹配的化合物結構進行驗證，從而進行峰認定，結果見表1。

表1 三棱特征圖譜特征峰的UPLC-Q/TOF-MS分析結果

圖3 三棱藥材UPLC-Q/TOF-MS總離子流色譜圖

峰6 準分子離子m/z685.198 4 [M-H]-，計算分子組成為C30H37O18，與三棱中含有的已知化學成分β-D-(O-乙酰基-O-阿魏酰基)呋喃果糖基-α-D-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷[15-18]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z193、175、160 的碎片離子，推測裂解途徑見圖4。三棱中含有該結構果糖上3 位、6 位阿魏?；〈漠悩嬻w和葡萄糖上2′、3′、4′、6′位乙酰基取代的異構體，僅通過二級質(zhì)譜不能確定準確的取代位置，因此，初步鑒定峰6為β-D-(O-乙?；?O-阿魏?；?呋喃果糖基-α-D-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷。

圖4 β-D-(O-乙?；?O-阿魏酰基)呋喃果糖基-α-D-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷的二級質(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰7 準分子離子m/z383.114 0 [M-H]-，計算分子組成為C21H19O7，與三棱中含有的已知化學成分1,3-O-二-對-香豆?；视王19]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z229、211、171 的碎片離子，推測裂解途徑見圖5。因此，峰7 初步鑒定為1,3-O-二-對-香豆?；视王?。

圖5 1,3-O-二-p-香豆?；视王サ亩壻|(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰8 準分子離子[M-H]-m/z413.125 8，計算分子組成為C22H21O8，與三棱中含有的已知化學成分1-O-阿魏?；?3-O-p-香豆?；视王19]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z193、177、163、145、134、119的碎片離子，推測裂解途徑見圖6，因此，峰8初步鑒定為1-O-阿魏酰基-3-O-p-香豆酰基甘油酯。

圖6 1-O-阿魏?；?3-O-p-香豆?；视王サ亩壻|(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰9 準分子離子m/z443.134 9 [M-H]-，計算元素組成為C23H23O9，與三棱中含有的已知化學成分1,3-O-二阿魏?；视王19]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z193、175、134 的碎片離子，推測裂解途徑見圖7，因此，峰9初步鑒定為1,3-O-二阿魏酰基甘油酯。

圖7 1,3-O-二阿魏?；视王サ亩壻|(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰10 準分子離子m/z861.224 9[M-H]-，計算分子組成為C40H45O21，與三棱中含有的已知化學成分β-D-(1-O-乙?；?3,6-O-二阿魏?；?呋喃果糖基-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷[19]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z819（脫乙酰基）、801（脫H2O）、193、175、160 的碎片離子，推測裂解途徑見圖8。三棱中含有該結構葡萄糖基上2′、3′、4′、6′位乙?；〈漠悩嬻w，僅通過二級質(zhì)譜不能確定準確的取代位置，因此，峰10初步鑒定為β-D-(1-O-乙?；?3,6-O-二阿魏?；?呋喃果糖基-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷。

圖8 β-D-(1-O-乙酰基-3,6-O-二阿魏酰基)呋喃果糖基-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷的二級質(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰11 準分子離子m/z295.227 7[M-H]-，計算分子組成為C18H31O3，三棱中未發(fā)現(xiàn)與該分子式一致的已知化學成分。二級質(zhì)譜如圖9 所示，可見分子離子脫去H2O，產(chǎn)生m/z277.217 2 碎片離子，而未見分子離子脫去CO2的碎片離子，推測該化合物含有1 個醇羥基，而不含羧基，不是脂肪酸類化合物。該分子離子中性丟失C9H16產(chǎn)生元素組成為C9H15O3的m/z171.102 3碎片離子。推測C1～C9存在2個雙鍵，并有3 個氧取代位；由C9H16的中性丟失，推測該化合物C10～C18 不含氧原子而且含有1 個雙鍵。由于在C9-C10 鍵斷裂，同時C11 上1 個H 轉(zhuǎn)移到C9，使C10-C11 形成雙鍵，這樣能夠與C12-C13 雙鍵形成穩(wěn)定的共軛體系，因此推測C10～C18鏈上雙鍵位于C12-C13。該化合物分子離子還產(chǎn)生m/z195.138 4 碎片離子，計算分子組成為C12H19O2，為分子離子中性丟失C6H12O 的離子；C6H12O 的中性丟失含有1 個雙鍵，為C6-C7 鍵斷裂時C5 上H 轉(zhuǎn)移至C7 后形成C5=C6 雙鍵，由此推測該化合物分子C1～C6 沒有雙鍵，那么另2 個雙鍵存在于C7～C9；m/z195.138 4 碎片離子分子式C12H19O2，而C10～C18 不含氧原子，推測C7～C9 有2 個氧原子，那么C7～C9 的結構為-CO-HC=COH-或-COH=CH-CO-，此結構為穩(wěn)定的共軛體系，其兩端的C-C 鍵容易斷裂，從而在二級質(zhì)譜上產(chǎn)生中性丟失C9H16、C6H12O 的碎片離子。以-CO-HC=COH-結構說明該化合物的裂解途徑見圖9。該化合物結構與三棱酸相似，因其化學結構含有烯酮結構，故暫稱其為三棱酮。

圖9 三棱酮的二級質(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

3 討論

三棱化學成分復雜，包括苯丙素、有機酸、黃酮、甾體、蒽醌、生物堿、揮發(fā)油、二苯基庚烷、環(huán)二肽、脂肪酸等類化學成分[5]，然而已報道的三棱化學成分指紋圖譜僅表征了香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、對香豆酸等大極性有機酸類成分[11-13]，主要原因是僅采用254 nm 或300 nm 的檢測波長，不能兼顧多種紫外吸收特征的成分。本研究利用PDA 檢測器，在200～400 nm 波長采集三棱供試品溶液色譜圖，經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)0～12 min 的色譜圖在300 nm 波長下色譜峰信息比較豐富，峰形良好，而在12～16 min 的色譜圖在240 nm 波長下可檢測到很強的色譜峰，即11 號峰。因此，本研究采用雙波長切換掃描的方式采集三棱指紋圖譜，0～12 min 在300 nm 波長采集，12～16 min 在240 nm 采集，從而能夠采集到更全面的三棱化學成分峰。

為說明本研究所建立的特征圖譜能夠表征三棱的主要化學成分，進一步利用對照品和UPLC-Q/TOF-MS 對三棱特征圖譜的特征峰進行了認定。與以往文獻報道的三棱指紋圖譜不同，本研究建立的特征圖譜除了表征阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸等極性有機酸類成分，還表征了苯丙素乙酰蔗糖酯、苯丙素甘油酯及一個十八碳烯酮成分（三棱酮），表明該指紋圖譜能夠更全面控制三棱藥材的物質(zhì)基礎。三棱具有破血行氣、消積止痛的功效，是活血化瘀要藥，具有抗血小板凝集和抗血栓作用、抗癌、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[2]，三棱抗癌和心血管方面的活性相關部位是以苯丙素類成分為主的小極性部位[20]，而本研究建立的特征圖譜中峰6～10 均屬于小極性苯丙素類成分，說明本特征圖譜表征了藥效相關成分，而以往的三棱指紋/特征圖譜中均未表征該類成分。另外，本研究利用UPLC-Q/TOF-MS 技術鑒定峰11 為一種十八碳烯酮，暫稱為三棱酮，該化合物峰強度高、含量穩(wěn)定，可代表三棱高級脂肪族化合物。因此，本研究建立的三棱UPLC-UV特征圖譜除了表征大極性的有機酸成分外，還能夠表征小極性苯丙素酯類成分及脂肪族化合物，能夠更有效地控制三棱藥材質(zhì)量。

4 結論

本研究建立了中藥三棱UPLC-UV特征圖譜，確定11個特征峰及對照圖譜，利用對照品認定了咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸的特征峰，利用UPLC-Q/TOF-MS 鑒定了5 個苯丙素酯類成分特征峰和1 個脂肪族化合物。該指紋圖譜更全面地表征了三棱主要化學成分，為三棱藥材質(zhì)量控制提供了新的方法。