蛋白質水解物類植物生物刺激劑簡介

申繼忠，余武秀

(上海艾農國際貿易有限公司，上海 200122)

1 植物生物刺激劑的定義和類別

歐洲生物刺激劑工業委員會(EBIC)最早給出了生物刺激劑的定義。美國2018年12月頒布的農業法案(2018 Farm Bill)也給出了植物生物刺激劑的定義，Ute Albrecht認為該定義與歐洲生物刺激劑工業委員會的定義基本一致[1]。根據此定義，生物刺激劑有2大類，一類是基于微生物的產品，另一類是基于非微生物類物質產品。非微生物類生物刺激劑產品很多，包括以下幾大類：腐殖酸類、海藻提取物及其他植物物質、幾丁質和殼聚糖及其他聚合物、蛋白質水解物及其他含氮物質、無機鹽(如硅和鈷)、復雜有機復合物等[1,2]。生物刺激劑的功效表現在以下幾個方面：提高水分利用率、提高養分利用率、促進根結構的發育和生長、增強抗病能力、誘導系統抗性產生、提高植物抗脅迫能力等。

2 蛋白質水解物類生物刺激劑

Giuseppe Colla等充分討論了蛋白質水解物的生產工藝及其對水解物組成的影響，以及動物源和植物源蛋白質水解物的優缺點等[3]。

蛋白質水解物的種類可以根據來源和生產方法予以分類(表1)[3]。

表1 蛋白質水解物的分類

生產工藝及蛋白質來源對蛋白質水解物的化學特性影響很大。蛋白質在酸性或堿性條件下的化學水解通常是生產動物性蛋白質水解物的首選方法。酸水解是在高溫(＞121 ℃)和高壓(＞220.6 kPa)下進行的激烈反應。在酸水解中，主要使用鹽酸和硫酸水解蛋白質，最常用的是鹽酸。堿性水解是一個相當簡單和直接的過程，蛋白質在加熱條件下溶解，然后添加堿性物如氫氧化鈣、鈉或鉀，并將溫度保持在一個理想的設定值。化學水解可以破壞蛋白質的所有肽鍵，因此蛋白質水解程度較高，游離氨基含量也高，某些氨基酸會被破壞(例如，色氨酸通常被酸水解完全破壞；部分半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸會丟失；天冬氨酸和谷氨酰胺可通過酸水解轉化為它的酸性形式)。

此外，其他有用的耐熱化合物(如維生素)也大部分在化學水解過程中被破壞。化學水解的另一個關鍵方面是把游離氨基從L-型轉化成D-型(外消旋作用)。由于生物體內蛋白質中的氨基酸都是以L-型存在的，因此植物在代謝過程中不能直接利用D-型氨基酸，故化學水解的蛋白質水解物將減效，甚至對植物構成潛在毒性。最后，大量使用酸/堿水解導致蛋白質水解物的鹽度增加。

酶法水解通常用于生產植物蛋白質水解物。酶法水解是通過源自動物器官(如胰酶、胃蛋白酶)或植物(如木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶)或微生物(如堿性蛋白酶、風味蛋白酶)等各種蛋白水解酶進行的。蛋白水解酶水解過程比酸/堿水解溫和，不需要高溫(＜60 ℃)，通常針對特定的目標肽鍵發生作用(例如，胃蛋白酶切斷含有苯丙氨酸或亮氨酸鍵的氨基酸鏈；木瓜蛋白酶切斷與精氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸相鄰的鏈；胰酶則在有精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的地方切斷氨基酸鏈)。酶解所產生的蛋白質水解物是一種含有不同長度的氨基酸和肽的混合物，含鹽度較低，其組成不隨時間而變化。

由上可知，通過不同的生產方法獲得的蛋白質水解物中，氨基酸含量、肽的含量和分子量分布會有很大不同。

除了氨基酸和肽外，蛋白質水解物還含有其他能起到生物刺激作用的化合物，包括脂肪、碳水化合物、酚類、礦物元素、植物激素和其他有機化合物(如多胺)。例如，在基于紫花苜蓿的蛋白質水解物中發現有兩種植物激素(即吲哚乙酸和異戊烯腺苷)，在紫花苜蓿衍生蛋白質水解物中發現有一種刺激植物生長的脂肪醇，即三十烷醇。此外，植物性蛋白質水解物含有在能量代謝和氧化應激防御中起重要作用的可溶性碳水化合物以及酚類物質。相比之下，動物性蛋白質水解物則缺乏碳水化合物、酚和植物激素。礦物含量也受蛋白質來源的影響，通常植物來源的蛋白質水解物含有更多的礦物質，肉粉的蛋白質水解物中存在大量的鈉，在植物源蛋白質水解物中有很高水平的鎂、錳、鐵和鋅等營養成分，由皮革作為原材料生產的蛋白質水解物可能含有重金屬鉻，它作為污染物受到特別關注。

不同來源和不同生產方法獲得的蛋白質水解物化學特性的異同點見表2[4]。

表2 基于不同來源蛋白和不同生產方法獲得的蛋白質水解物化學特性

3 氨基酸和肽對植物的重要性

近年來，發現植物氮代謝的許多過程和代謝途徑明顯受到全部或幾種氨基酸和酰胺濃度的調控。氨基酸和酰胺在硝酸鹽和銨態氮吸收、硝態氮還原、銨態氮摻入、蛋白質代謝和氮再動員中起重要作用。研究表明，游離氨基酸的濃度與植物的氮素狀態有關，游離氨基酸可能參與了植物生長和氮素代謝的調控[5]。

氨基酸對植物的抗脅迫能力也有積極影響。受脅迫的植物表現出脯氨酸和其他氨基酸的積累，被積累的氨基酸所起的作用有：作為滲透物、調節離子運輸、調控氣孔開放和解毒重金屬。氨基酸也影響某些酶的合成和活性、基因表達和氧化還原平衡[6]。

蛋白質水解物對植物非生物脅迫有改善作用。非生物脅迫對作物生產產生不利影響，導致其產量下降。在不同的非生物脅迫中，干旱是最重要的一種，因為有限的水分供應對植物的生長和發育有負面影響。Silvana Francesca等研究番茄在有限水分供應下，生物刺激素與關鍵生理反應機制之間的相互作用，并為提高番茄在干旱脅迫下的性能制定策略。采用一種新型蛋白質水解生物刺激劑(商品名CycoFlow，意大利Agriges公司)，研究了在最優條件(100%灌溉)和有限水分供應(50%灌溉)條件下生長的番茄(基因型E42)的生理反應。與未處理相比，經水解蛋白處理的植株在干旱脅迫下表現出更好的水分狀況和花粉活力，產量也更高。生物刺激素處理對葉片和果實中抗氧化物質的含量和活性也有影響。這些研究結果表明，蛋白質水解物應用在有限水分供應時能夠改善植株的性能[7]。

氨基酸是所有生物合成蛋白質的重要組成部分，在植物中，游離的“蛋白質源”氨基酸在氮的同化和運輸中起著補充的作用，是信號化合物、滲透劑以及制造各種激素、輔助因子和其他主要化合物(如葉綠素)的前體。植物還利用氨基酸的集體作用產生數千種特殊化合物，促進生態相互作用，并對環境脅迫作出適應性反應。

植物中的氨基酸也可以聚合成小肽，通常由 5到60個氨基酸組成。某些小肽在植物生長和發育中起類似激素的作用。另一些則在傷口、病原體感染、營養失衡、干旱或高鹽度下發揮作用。

20世紀80年代和90年代，通過從各種植物組織中分離出的膜泡進行吸收測定，開始了對氨基酸和多肽吸收和轉運的生化過程研究。利用放射性標記底物和熒光標記方法，揭示了多種氨基酸和肽轉運過程的發生。從那時起，在非菌根植物擬南芥中發現了至少12個轉運體家族的成員。還有研究揭示了轉運蛋白在土壤氨基酸攝取、進出細胞和/或植物維管系統長途運輸中的作用[8,9]。

氨基酸在植物中的作用非常之多，各種作用正在不斷被發現。目前已知的最重要作用有[10]：⑴ 提高葉綠素產量；⑵ 提供豐富的有機氮來源；⑶ 刺激維生素的合成；⑷ 影響許多酶系統；⑸ 刺激開花；⑹ 促進果實的形成；⑺ 提高產量，改善果實的味道、大小和顏色；⑻ 提高農產品質量；⑼ 增強植物抗性。

肽是由 2～50個氨基酸通過肽鍵連接而成的分子。超過50個氨基酸組成的分子稱為蛋白質。蛋白質的水解不僅能釋放氨基酸，還能釋放因水解程度不同而含量不同的可溶性肽。軟水解，如酶水解，比化學水解產生更多的肽。

肽作為信號分子在植物生理中起著重要的作用，能調節植物防御機制以對脅迫、生長和發育做出反應。肽分子在細胞膜層面起激活植物特定代謝作用[4]。

生物活性肽在農業上具有廣泛的應用前景，作為有效的營養和藥劑用途已被充分證明，但在解決生物和非生物脅迫、植物病害控制和營養利用效率等農業應用方面尚未受到太多關注。生物活性肽能夠增強植物根際分子信號傳導，促進結瘤、營養吸收和脅迫管理，可與農藥配制，并在葉片處理中通過葉片系統吸收，以實現廣泛的植物效益，包括著色、干旱條件下的營養傳遞、植物健康和作物保護等[11]。

4 蛋白質水解物類刺激劑的功效

蛋白質水解物可影響植物的生長、礦質營養利用、對非生物脅迫的耐受性以及植物的根際微生物群落。蛋白質水解物產品之所以具有這些功效，是因為其含有生長刺激肽和氨基酸，而所含氨基酸是一些植物激素的代謝前體(例如色氨酸是吲哚乙酸的前體，精氨酸是多胺的前體)。蛋白質水解物對植物氮營養也有積極影響，因為氨基酸和肽中的有機氮可以作為植物氮的直接來源，它們可被快速吸收、同化和轉運到地上部分。然而，這些氮的使用濃度很低，使用目的不是向作物提供大量的氮素。

蛋白質水解物對植物營養的積極作用還體現在氨基酸和肽能夠復合礦物質，提高礦物質的溶解度，從而提升其可利用度。蛋白質水解物特別有利于提高鐵、錳、鋅等微量元素在堿性環境中的生物有效性。

蛋白質水解物還可以通過激活參與營養吸收的特定根酶來改善作物營養。例如，在根和葉面施用植物源蛋白質水解物可以提升番茄根鐵螯合還原酶活性，從而在堿性脅迫條件下增加植物對鐵的吸收。但是使用動物源的蛋白質水解物對鐵螯合還原酶活性的影響則較小。

蛋白質水解物除了能促進養分的吸收、轉運和積累外，還能提高作物對非生物脅迫的耐受性，如不適宜的溫度和濕度脅迫、鹽度、干旱和弱光條件等。例如，萵苣對低溫的耐受性可因為葉面施用蛋白質水解物而提高。蛋白質水解物提高植物對非生物脅迫耐受性的積極作用歸因于根系生長更好、根莖比更高、植株營養狀況更好、較高的細胞膜穩定性、滲透物(如脯氨酸)和抗氧化劑的積累。

蛋白質水解物可以增加水果的品質，許多氨基酸如丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸是芳香化合物的前體，苯丙氨酸是花青素生物合成的前體，精氨酸、丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸是風味的前體物質。

根部使用蛋白質水解物還能刺激土壤微生物的生長，改變微生物區系，有助于提高土壤的整體生物肥力[4,12]。

Christoph Stephan Schmidt等通過盆栽試驗，比較了一種新型雞毛水解物(FH)和一種參考蛋白質水解物(RH)對大麥和小麥的生物刺激作用，研究了它們與叢枝菌根真菌(AMF)和磷的交互作用。結果表明所有試驗因素都影響大麥生長，其中 FH增加大麥的莖高和生物量，RH降低莖高和生物量，AMF降低高磷供應下大麥的生物量。在小麥中，AMF處理組的生物量略有降低，而其他因子對生物量的影響不顯著。在田間平行試驗中，RH和FH對大麥產量和籽粒大小均有提高作用，而2種水解液對小麥均無顯著影響。施用時間對水解液效果無影響。兩種酶解物在盆栽試驗中均能增加大麥網斑病的嚴重程度，而在田間試驗中則能降低網斑病的嚴重程度。FH促進了低磷條件下AMF在小麥根系的定殖。研究結果表明盆栽測試結果在田間條件下的可轉移性有限，并顯示了水解產物、土壤磷、植物共生物和病原體之間復雜的相互作用[13]。

為了滿足人們對綠色蔬菜日益增加的需求，種植者在高能量投入下種植葉菜作物，尤其是施用高劑量的氮肥。氮肥的過量使用會導致硝酸鹽在植物葉片中積累，有時甚至超過了歐洲設置的最高限量。葉片中的硝酸鹽可能對人體健康有害，因為在人體內它可以轉化為亞硝酸鹽，這會導致高鐵血紅蛋白血癥或產生致癌化合物。為了克服這一問題，需要正確的氮素管理，特別是采用提高氮素利用效率的技術手段。Mola(2020)評估了 2種重要的植物生物刺激劑對溫室中小葉萵苣產量和品質性狀(硝酸鹽、抗氧化劑活性和類胡蘿卜素)的影響。施氮量分別為0、10 (次優)和20 (最優) kg/hm2，所用生物刺激劑為海藻提取物“Ecklonia Maxima”(3 mL/L)以及豆科植物蛋白質水解物，并設未經處理的對照。海藻提取物和豆科植物源蛋白質水解物的應用提高了產量和葉面積指數(LAI)，比未處理的植物分別提高了13.4%和12.0%；20 kg/hm2氮處理的產量最高。葉面生物刺激素刺激植物抗氧化系統，改善葉片顏色，提高葉綠素和類胡蘿卜素含量。在較高施氮水平下，葉片中硝態氮含量增加，在20 kg/hm2氮處理下硝態氮達到歐洲法定限量。因此，在試驗條件下，可以通過增加施用生物刺激素來減少氮肥施用量并盡可能降低產量損失[15]。

Gianluca Caruso等在意大利南部評估了2種植物生物刺激劑(豆科植物蛋白質水解物，Trainer?；熱帶植物提取物，Auxym?)對細葉二行芥的影響。在3個作物周期(秋-冬、冬、冬-春)對葉片產量、光合作用和色澤狀況、品質、元素組成、抗氧化劑含量和活性的影響進行評價。這兩種生物刺激劑能促進多年生二行芥生長和生產力，冬-春周期的葉片產量高于冬期；能提高葉片干物質、草酸、檸檬酸、鈣、磷、酚類物質和抗壞血酸含量及抗氧化活性，但沒有增加硝酸鹽的含量，冬-春周期誘導的抗氧化活性和各物質含量均高于冬期；這些主要是跟這 2種生物刺激劑含有的氨基酸和可溶性多肽相關，盡管Auxym?也含有少量的植物激素和維生素。另外，這2種植物生物刺激劑都能提高蔬菜產量、營養和功能品質，提高作物產量的機制可能是因為提高了礦物質養分的有效性和吸收[16]。

5 蛋白質水解物生物刺激劑商業化及應用

Moses Madende和Maria Hayes收集整理了一些商業化蛋白質水解物制劑及其蛋白質來源、有效成分、使用方法、應用作物和功效(表3)。從表3可以看出，這些產品來自植物、動物或微生物，其主要成分是氨基酸和肽，還有些產品含有激素和礦物元素，它們多被應用在蔬菜和水果等高附加值作物上[17]。

表3 商業化的生物刺激劑及其組成和使用策略

美國FBN公司推出的植物蛋白質水解物刺激劑產品，聲稱含有18種氨基酸[18]，產品有效成分以氨基酸和肽計為31%，含有機氮5.0%，有機質總含量35.5%，含可溶性肽形式的氨基酸，游離氨基酸含量少于4%，并聲稱可用于所有作物(表4)。

表4 生物刺激劑ATARRUS中的氨基酸譜(各種氨基酸所占百分比例)

意大利ILSA S.p.A.公司生產的蛋白質水解物刺激劑產品APR?，在水培條件下將該產品應用于玉米苗，觀察對照組和3種不同脅迫(缺氧、鹽和營養缺乏)及其組合的條件下玉米苗的變化。結果表明，APR?是可溶性的，能夠影響根和莖的生長，影響程度與刺激劑的使用濃度有關。此外，APR?的有效性在單個脅迫或組合脅迫條件下明顯提高，從而證實了先前假設的該產品對環境逆境有抵抗能力。此外，它還調節參與硝酸鹽運輸和活性氧(ROS)代謝的一組基因的轉錄[19]。

蛋白質水解物可以施用于根或葉面，其用量為1.5～5 L/hm2。一般建議低濃度多次使用，不建議高濃度臨時使用。苗期使用蛋白質水解物對幼苗生長有較快的促進作用，還能促進根的生長和植株的快速定植，在生長旺盛的時期通過根和葉面施用則可以加強光合作用，從而促進植物的生長和養分利用效率。特別重要的是，在生產階段通過葉面使用蛋白質水解物可以提高水果和蔬菜的質量以及食用產品的營養價值。在不利的環境條件下，建議用蛋白質水解物進行預防處理，以增強植物對非生物脅迫的耐受性(例如積累滲透物和次生代謝物)[4]。