苦蕎漆酶基因的克隆與生物信息學分析

楊曉琳 段 迎 蔡蘇云 賀潤麗 尹桂芳王艷青 盧文潔 孫道旺 王莉花

（1山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，030619，山西太原；2云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業農村部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，650221，云南昆明）

苦蕎[Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn]為雙子葉蓼科一年生草本植物，作為藥食兼用作物，富含抗性淀粉、高活性蛋白和膳食纖維等營養成分，以及蘆丁和槲皮素等黃酮類生物活性成分，具有降壓、降脂和降膽固醇等功效[1-4]。由于苦蕎米具有極高的營養藥用價值，其產品也在不斷被研發，開發方向日益廣泛，使得人們對苦蕎米的需求量不斷提高。根據果殼厚度，苦蕎可分為厚殼型和薄殼型2類[5]。普通栽培苦蕎由于種皮厚、難脫殼形成整粒生蕎米，降低了苦蕎的營養活性成分和加工利用價值；薄果殼突變體由于易脫殼成整粒生蕎米，但適應性差和產量低等導致其難以推廣種植，所以薄果殼苦蕎成為研究和育種的熱點。

漆酶（laccase）是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于真菌、細菌和植物中，在高等植物中通過氧化還原反應催化各種底物，參與到植物的各種生理反應中。研究[6-8]發現擬南芥共有17條漆酶基因（AtLAC1～AtLAC17)，根據功能分為6類，其中AtLAC4和AtLAC17參與木質素合成，既引導又指導細胞壁的木質化。已有證據[9-10]表明漆酶能夠參與細胞壁形成，參與調控木質素單體的聚合過程，在植物木質素合成中起著重要的作用。在楊樹中抑制漆酶基因的表達，木質素總含量組成都沒有發生變化，但導致楊樹木質部纖維細胞壁的變形脫落，表明漆酶對木質部纖維及細胞壁結構完整性有重要影響[11]。

吳朝昕[12]對苦蕎果殼成分進行研究，發現厚果殼苦蕎果殼木質素含量高于薄果殼苦蕎。本課題組前期研究以云蕎1號與小米蕎雜交F2為遺傳材料，利用轉錄組測序技術，分析比較苦蕎薄果殼和厚果殼中差異表達基因，發現木質素生物合成途徑大部分基因在苦蕎厚果殼的表達量高于薄果殼，推測苦蕎薄果殼性狀與木質素成分合成和積累量低有關。對轉錄組數據中木質素合成途徑差異基因分析結果表明，漆酶基因在薄果殼苦蕎中的表達量顯著低于厚果殼苦蕎。基于轉錄組測序結果，本試驗以苦蕎為材料，運用RT-PCR技術對木質素生物合成途徑的關鍵基因漆酶基因進行克隆，并對其進行序列、蛋白理化性質、系統進化樹和實時熒光定量PCR表達分析，為闡明苦蕎薄果殼形成的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別采用云蕎1號（云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所選育的厚果殼品種）和小米蕎（云南地方薄果殼品種）不同發育期果實的混合材料進行基因克隆。選用云蕎1號和小米蕎結實期不同部位組織材料（即結實期的葉、花、莖、果殼和種子）進行熒光定量PCR分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 根據轉錄組測序序列及漆酶中4個銅原子附近的氨基酸保守序列，分別設計了8條引物用于RT-PCR基因克隆（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列及用途Table 1 Sequences of primers and their usage

1.2.2 RNA提取與cDNA第1鏈合成 根據Trizol提取試劑盒，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，操作說明分別對苦蕎厚果殼和薄果殼混合材料進行總RNA提取。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗提取結果，選擇完整性較好、條帶清晰且無降解的總RNA進行反轉錄。

在0.2mL的PCR管中加入總RNA 5μL、隨機引物 1μL和 ddH2O 1μL，70℃溫浴 5min，冰浴2min；離心加入試劑 5× First-Strand Buffer 2.0μL、10mmol/L dNTP 0.5μL、Rnase inhibitor 0.25μL 和Reverse Transcriptase 0.25μL，總體積 10.0μL，42℃溫浴60min，72℃溫浴10min。

1.2.3 RT-PCR基因克隆 以苦蕎總RNA反轉錄合成的cDNA第1鏈為模板，采用25μL的PCR反應體系進行PCR擴增，包括2×GC Buffer I 12.5μL、上游引物(10μmol/L)0.5μL、下游引物（10μmol/L）0.5μL、dNTP（10mmol/L）0.2μL、ddH2O 10.1μL、cDNA模板1μL和Taq酶（5U/μL）0.2μL。PCR反應擴增程序為95°C預變性3min；94°C變性30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 90s，循環 33 次；72°C修復延伸7min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用試劑盒回收純化目的條帶，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.4 漆酶基因及其編碼蛋白序列分析 將克隆所得基因序列在NCBI（http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/Blast.cgi）進行 Blast比對，在 ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）中查找基因的ORF，翻譯獲取氨基酸序列。使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）工具在線對苦蕎漆酶蛋白結構域進行預測分析；用在線軟件EX Pasy（https://web.expasy.org/protparam/）分析編碼蛋白基本理化特性，用protscale（https:/web.expasy.org/protscale/）工具對其親、疏水性進行預測；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線分析苦蕎漆酶蛋白二級結構；應用SWISS-MODEL（http://swiss model.expasy.org/）模擬構建FtLAC-1和FtLAC-2蛋白的三級結構模型。在NCBI上的Blastp同源比對，將高分值序列在DNAMAN進行序列比對，并用MEGA 6.0軟件構建苦蕎漆酶與其他植物漆酶NJ系統進化樹[13-15]。

1.2.5 漆酶基因熒光定量PCR（qRT-PCR）分析用Primer Premier 5.0軟件設計目的基因及內參基因引物序列（表1）。qRT-PCR擴增程序：95℃預變性30s，隨后進行45個循環：95℃變性5s，60℃退火30s。以苦蕎FtH3（JF769134.1）為內參基因，利用2-ΔΔCt法計算出基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 苦蕎RNA提取及漆酶基因的克隆結果

RT-PCR擴增產物電泳結果如圖1所示，在800和2500bp左右有明顯的擴增條帶。PCR產物回收測序，將測序序列進行拼接組裝，得到最終序列。經過序列比對發現克隆到的2條laccase基因在云蕎1號（厚果殼）和小米蕎（薄果殼）中的序列一致性為100%，且與轉錄組測序序列高度一致，可見LAC-1和LAC-2基因在薄殼苦蕎和厚殼苦蕎中沒有突變和分化，所以命名為FtLAC-1和FtLAC-2。FtLAC-1和FtLAC-2基因開放閱讀框長度分別為1695和1707bp，各編碼564和568個氨基酸。

圖1 苦蕎LAC-1和LAC-2克隆基因電泳圖Fig.1 Amplification of the LAC-1 and LAC-2 genes from tartary buckwheat

2.2 苦蕎漆酶基因生物信息學分析

2.2.1 漆酶蛋白理化性質分析 使用Pfam對漆酶蛋白的結構域進行預測，結果（圖2）顯示，2個基因編碼蛋白均含有3個經典銅離子結構域，即Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cuoxidase-2結構域，說明FtLAC-1和FtLAC-2均可能具有漆酶蛋白的基本功能。利用EX PASy工具進行預測，進一步了解苦蕎漆酶蛋白的理化特性以及潛在功能，結果顯示，FtLAC-1和FtLAC-2蛋白分子量分別為61.41和62.47kD，理論等電點為9.45和9.41，FtLAC-1蛋白分子式為C2796H4336N760O771S15，帶負電氨基酸35個，帶正電氨基酸53個，不穩定系數為35.29；FtLAC-2蛋白分子式為C2837H4329N765O804S14，帶負電氨基酸27個，帶正電氨基酸41個，不穩定系數為28.46。

圖2 FtLAC-1和FtLAC-2蛋白結構域Fig.2 Conserved domains of gene-encoded proteins of FtLAC-1 and FtLAC-2

對疏水/親水性進行預測，結果見圖 3，FtLAC-1和FtLAC-2平均親水性分別為-0.030和-0.121，可知這2個氨基酸序列編碼蛋白均為親水性蛋白。

圖3 苦蕎漆酶親疏水性分析Fig.3 Analysis of hydrophobicity of laccase proteins

2.2.2 漆酶蛋白結構分析 利用SOPMA在線對苦蕎漆酶蛋白進行二級結構結構預測，表明FtLAC-1蛋白二級結構中α-螺旋占15.07%、無規則卷曲占50.89%、延伸鏈占27.48%和β-轉角占6.56%；FtLAC-2蛋白的二級結構由12.68%的α-螺旋、6.34%的β-轉角、52.29%的無規則卷曲和28.70%的延伸鏈構成。利用SWISS-MODEL對蛋白質的三級結構進行預測，可能的構型如圖4所示。

圖4 苦蕎漆酶蛋白三級結構預測Fig.4 The prediction of tertiary structural model of laccase proteins

2.2.3 漆酶蛋白同源比對及進化樹分析 在NCBI中對FtLAC-1和FtLAC-2進行比對，結果顯示2個氨基酸序列相似性并不高。經BLAST序列分析得到FtLAC-1與橡膠樹Hevea brasiliensis（Willd.ex A.Juss.）Muell.Arg.（XP 021662642.1）和阿月渾子Pistacia vera L.（XP 031276156.1）的序列一致性分別高達82.62%和80.72%，FtLAC-2與甜菜亞種Beta vulgaris subsp.vulgaris（XP 010685719.1）和林煙草 Nicotiana sylvestris Speg.（XP 009796024.1）序列一致性分別為72.17%和72.06%。選取BLAST比對一致性較高的序列與之進行多序列比對，結果見圖5。

圖5 漆酶氨基酸序列比對Fig.5 Amino acid sequence alignment of different plant laccase proteins

為了分析苦蕎漆酶蛋白基因FtLAC-1和FtLAC-2的親緣進化關系，采用MEGA 6.0對苦蕎漆酶基因編碼的氨基酸序列同來自NCBI數據庫中其他植物漆酶氨基酸序列進行系統進化樹的構建，結果如圖6所示，從進化樹中可以看出FtLAC-1和FtLAC-2分別與不同植物分為兩大類，FtLAC-2與甜菜單獨聚在一個小分支，說明二者具有較近的親緣關系；FtLAC-1與擬南芥AtLAC4聚在一大簇，FtLAC-2與擬南芥AtLAC17聚在一大簇，已有研究[6-7]證實擬南芥AtLAC4和AtLAC17參與木質素合成，推測FtLAC-1和FtLAC-2基因也可能參與木質素的合成。

圖6 不同植物漆酶蛋白序列系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree analysis of laccase proteins from different species

2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）表達分析

應用qRT-PCR技術分析FtLAC-1和FtLAC-2基因在厚果殼和薄果殼苦蕎不同組織器官的表達量，結果見圖7。從不同組織器官來看，漆酶基因FtLAC-1和FtLAC-2在苦蕎不同組織的表達量不同，在厚果殼與薄果殼苦蕎中均表現為在種子中的表達量高于其他組織器官，推測材料選取時期正處于苦蕎果實生長膨大期，相關基因活躍，表達量較其他部位高。FtLAC-1在厚果殼苦蕎果殼中的表達量約是薄果殼的9倍，在厚果殼苦蕎花的表達量遠遠高于薄果殼；FtLAC-2在苦蕎厚、薄果殼中表達量基本一樣，但在厚果殼苦蕎莖、花和葉中的表達量高于薄果殼苦蕎。總體來看，FtLAC-1和FtLAC-2基因在厚果殼苦蕎不同組織器官的表達量均高于薄果殼苦蕎。

圖7 FtLAC-1和FtLAC-2基因在各器官的相對表達量Fig.7 Relative expression of FtLAC-1 and FtLAC-2 genes in various organs

3 討論

隨著我國“三高”人數越來越多，苦蕎顯著的藥理作用及營養價值引來食品和藥品等行業越來越多的關注，所以開展易于加工且高產質優的薄果殼苦蕎品種選育研究是醫療保健行業、農業生產和加工企業的共同需求[16]。

吳朝昕[12]研究發現薄殼苦蕎果殼纖維素和木質素含量顯著低于厚殼苦蕎。本課題組前期研究轉錄組測序，分析發現木質素合成途徑基因大多在薄果殼苦蕎的表達量低于厚果殼，為了深入驗證苦蕎薄果殼形成的分子機制，本試驗運用RT-PCR技術從云蕎1號和小米蕎的不同發育時期混合材料中成功克隆獲得2條苦蕎漆酶基因FtLAC-1和FtLAC-2，開放閱讀框長度分別為1695和1800bp，編碼564和568個氨基酸，經預測2個蛋白均為親水性蛋白，此外，苦蕎漆酶蛋白FtLAC-1和FtLAC-2都具有3個典型的銅區保守域Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cu-oxidase-2，表明其與其他植物漆酶蛋白具有相似的功能。但2個蛋白的二級和三級結構特征存在差異，2個基因序列不具有較高相似性，其氨基酸序列同源性低。

研究[17]表明，植物漆酶參與調控單體聚合，在木質部或正在木質化的組織中表達量高，參與調控木質素的積累過程。陳亮[18]研究發現，在丹參中過表達漆酶基因促進發根的生長，使得根系加粗，用顯微鏡觀察丹參發根的橫截面，看到木質部范圍變大，染色后凱式帶的紫色加深，說明漆酶加強了其木質化程度。漆酶基因在高等植物木質素合成中起著重要作用，其表達差異也會引起植物木質化結構表現差異。有研究[19-23]發現，當漆酶表達受到抑制時會減少木質素的積累，而木質素含量降低會影響植物木質化結構的表達，例如果核的殘核和軟核，利用該表達特點可進一步研究漆酶表達調控機制。本研究采用qRT-PCR技術分析基因表達模式，結果顯示FtLAC-1和FtLAC-2在厚、薄果殼型苦蕎不同組織器官中表達量不同，其中在種子的表達量最高。FtLAC-1和FtLAC-2在厚果殼苦蕎不同組織器官的表達量均高于薄果殼苦蕎，推測厚果殼木質素積累多與漆酶基因的高表達有一定的關系。經課題組前期轉錄組差異表達基因分析，薄果殼苦蕎中與木質素生物合成途徑相關的大部分基因表達下調，且在厚果殼中的表達量高于薄果殼苦蕎，與本研究漆酶基因表達趨勢相同，但有研究[24-25]發現在軟籽石榴種皮的硬度發育中，漆酶基因會促進木質素合成積累，可以推斷漆酶基因與苦蕎果殼木質素合成代謝有緊密聯系。但FtLAC-1和FtLAC-2基因在果殼不同組織器官表達模式不同，其在果殼木質素合成和積累中的具體功能還需進一步驗證。

4 結論

從苦蕎中克隆出2條漆酶基因FtLAC-1和FtLAC-2，生物信息學分析結果推測二者具有其他植物漆酶蛋白相似功能。qRT-PCR基因表達分析結果顯示，FtLAC-1和FtLAC-2在厚果殼苦蕎中的表達量高于薄果殼苦蕎，推測其在薄果殼苦蕎中低表達與薄果殼的木質素合成積累低有關，但具體功能還有待進一步驗證。