冷藏小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選鑒定及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析

孟凌云 戴澤川 李嬌 毛相朝

摘 要：以4 ℃貯藏小龍蝦貨架期終點(diǎn)篩選武漢孝感小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌，同時(shí)結(jié)合高通量測(cè)序方法，進(jìn)一步確定小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌，并對(duì)小龍蝦貯藏過(guò)程中菌相變化、微生物結(jié)構(gòu)及其多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：傳統(tǒng)培養(yǎng)法從腐敗小龍蝦中共篩選出10 株腐敗菌，包括波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）等;在屬水平上，高通量測(cè)序法最終確定氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）

及希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）是小龍蝦腐敗末期相對(duì)豐度最大的2 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌;同時(shí)，高通量測(cè)序結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，小龍蝦微生物群落豐富度、多樣性及均勻度不斷下降，這與腐敗末期優(yōu)勢(shì)腐敗菌的大量增長(zhǎng)及生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中抑制其他種類微生物有關(guān)。

關(guān)鍵詞：冷藏小龍蝦;優(yōu)勢(shì)腐敗菌;傳統(tǒng)培養(yǎng)基法;高通量測(cè)序;微生物多樣性

Screening and Identification of Dominant Spoilage Organisms and Analysis of Bacterial Community Structure and Diversity in Refrigerated Crayfish

MENG Lingyun1， DAI Zechuan1， LI Jiao1，*， MAO Xiangzhao1，2

（1.College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao 266003， China; 2.Qingdao National Pilot Laboratory for Marine Science and Technology/Laboratory for Marine Drugs and Biologiacal Products， Qingdao 266237， China）

Abstract： At the end of the shelf life of crayfish stored at 4 ℃， the dominant spoilage organisms in crayfish from Xiaogan， Wuhan were isolated and identified by high-throughput sequencing， and the changes in the bacterial community structure and diversity in crayfish during storage were analyzed. The results showed that 10 spoilage bacterial strains were obtained by the traditional culture-dependent method， including Shewanella baltica， Aeromonas veronii and Proteus vulgaris， etc. Aeromonas sp.

and Shewanella sp. were confirmed as the dominant spoilage organisms， with the largest relative abundance at the end of crayfish spoilage. At the same time， the results of high-throughput sequencing showed that the abundance， diversity and evenness of the microbial community decreased with storage time， which was related to the rapid growth of the dominant spoilage organisms and the inhibition of other kinds of microorganisms at the end of the spoilage stage.

Keywords： refrigerated crayfish; dominant spoilage organism; traditional culture-dependent method; high-throughput sequencing; microbial diversity

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220505-050

中圖分類號(hào)：TS254.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2022）06-0016-07

引文格式：

孟凌云， 戴澤川， 李嬌， 等. 冷藏小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選鑒定及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析[J]. 肉類研究， 2022， 36（6）： 16-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220505-050.? ? http：//www.rlyj.net.cn

MENG Lingyun， DAI Zechuan， LI Jiao， et al. Screening and identification of dominant spoilage organisms and analysis of bacterial community structure and diversity in refrigerated crayfish[J]. Meat Research， 2022， 36（6）： 16-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220505-050.? ? http：//www.rlyj.net.cnFE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

小龍蝦，也稱克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），屬于淡水經(jīng)濟(jì)蝦類，原產(chǎn)于北美洲地區(qū)，19世紀(jì)30年代引入我國(guó)[1-2]。因其風(fēng)味獨(dú)特、肉質(zhì)鮮美，同時(shí)具有高蛋白、低熱量的特性[3]，受到廣大消費(fèi)者的喜愛，成為人們餐桌上常見的美食。水產(chǎn)品由于營(yíng)養(yǎng)豐富且水分含量較高而容易引起細(xì)菌的增殖進(jìn)而腐敗，難以保存[4-6]。而小龍蝦好溫喜濕，常見于淤泥等復(fù)雜生長(zhǎng)環(huán)境，因此其本身攜帶的微生物種類和數(shù)量更多。同時(shí)，小龍蝦含有大量的自由氨基酸及內(nèi)源氧化酶，因此相較于其他水產(chǎn)品而言，更容易遭到微生物的侵襲[7-8]，這些都在一定程度上影響了小龍蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

大量研究發(fā)現(xiàn)，在水產(chǎn)品腐敗過(guò)程中部分種類細(xì)菌的數(shù)量逐漸上升并占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，對(duì)水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)起著主導(dǎo)作用，這些細(xì)菌被稱為優(yōu)勢(shì)腐敗菌[9]，其為水產(chǎn)品品質(zhì)下降最重要的原因。不同水產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌種類會(huì)存在一些差異，于淑池等[10]發(fā)現(xiàn)，冷藏卵形鯧鲹中優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌及假單胞菌，Leroi等[11]在4 ℃冷藏生鮭魚中發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要為假單胞菌，南美白對(duì)蝦中主要腐敗菌則為不動(dòng)桿菌、希瓦氏菌[12]，而淡水水產(chǎn)品，如鰱魚和草魚中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要為氣單胞菌[13]和假單胞菌[14]。對(duì)于水產(chǎn)品中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選和鑒定，在早期的研究中一般都是利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法

進(jìn)行[15-16]。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展，目前研究中廣泛利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合高通量測(cè)序法對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行篩選和鑒定。同時(shí)，高通量測(cè)序方法還可以對(duì)貯藏過(guò)程中水產(chǎn)品的微生物結(jié)構(gòu)組成及其多樣性進(jìn)行分析，目前已在帶魚[17]、牡蠣[18]等水產(chǎn)品中成功應(yīng)用，明確了微生物在產(chǎn)品貯藏過(guò)程中的變化趨勢(shì)。

本研究篩選和鑒定武漢孝感小龍蝦4 ℃貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，并對(duì)小龍蝦貯藏過(guò)程中菌相變化以及微生物菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性進(jìn)行分析。優(yōu)勢(shì)腐敗菌是水產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵控制點(diǎn)，與水產(chǎn)品貨架期密切相關(guān)，因此開展對(duì)小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的研究與篩選鑒定，有利于下一步利用殺菌保鮮技術(shù)靶向殺滅優(yōu)勢(shì)腐敗菌，提高保鮮效果，延長(zhǎng)小龍蝦貨架期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小龍蝦來(lái)源于武漢孝感，經(jīng)加冰?；钸\(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室備用，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作前加冰猝死。

氯化鈉、硼酸、氧化鎂、鹽酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、假單胞菌選擇性瓊脂（Pseudomonas CFC selective agar，CFC）培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂（triple sugar iron agar，TSI）培養(yǎng)基、BP（Baird-Parker）培養(yǎng)基、氣單胞菌基礎(chǔ)（Aeromonas medium base，RYAN）培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

K9840自動(dòng)凱氏定氮儀 海能儀器有限公司;JY2002電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;

TS-2402CL恒溫振蕩器 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限

公司;GXM-358恒溫培養(yǎng)箱 寧波江南儀器制造廠;GI80TW全自動(dòng)高壓滅菌器 南京庚辰儀器科學(xué)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小龍蝦貯藏期間菌落總數(shù)的測(cè)定

采用活菌平板計(jì)數(shù)法，測(cè)定小龍蝦中總需氧菌菌落總數(shù)，測(cè)定方法參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。稱取10 g蝦肉，加入90 mL無(wú)菌生理鹽水，在無(wú)菌條件下勻漿，制成10 g/100 mL樣品均質(zhì)液。之后用生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋。取稀釋后的樣品100 μL涂布于NA平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，選取合適的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

1.3.2 小龍蝦貯藏期間總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的測(cè)定

每隔2 d測(cè)定小龍蝦中TVB-N含量，測(cè)定方法參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的方法二自動(dòng)凱氏定氮儀法。準(zhǔn)確稱取2 g蝦肉糜于蒸餾管中，之后加入75 mL純水，振蕩使樣品均勻分散，并在水中浸漬30 min。測(cè)定前加入1 g MgO，將蒸餾管連接至自動(dòng)凱氏定氮儀。以20 g/L硼酸為接收液，0.01 mol/L鹽酸為滴定液，1 g/L甲基紅-乙醇溶液和1 g/L溴甲酚綠-乙醇溶液以體積比1∶5混合作為混合指示劑。

1.3.3 腐敗菌單菌落的分離及純化

將鮮活小龍蝦碎冰猝死后，置于4 ℃條件下貯藏，選擇貯藏腐敗終點(diǎn)的小龍蝦樣品按照1.3.1節(jié)中的方法制成菌懸液，進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇合適稀釋倍數(shù)菌液均勻涂布于NA、CFC培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基、BP培養(yǎng)基、RYAN培養(yǎng)基，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h，在選擇性培養(yǎng)基上挑選不同顏色、形態(tài)的菌落，挑取單菌落并進(jìn)行2～3 次劃線純化，并于-80 ℃保存。

1.3.4 腐敗菌菌種的鑒定

1.3.4.1 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

腐敗菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中孵育至對(duì)數(shù)穩(wěn)定期，提取細(xì)菌DNA并進(jìn)行16S rDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，最終產(chǎn)物送往北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）與Gen Bank庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)。選取相似性在98%以上的菌株序列，利用MEGA 7.0.26軟件中的鄰近法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4.2 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等，應(yīng)用一系列生理生化實(shí)驗(yàn)，將篩選得到的腐敗菌菌種作進(jìn)一步鑒定。

1.3.5 高通量測(cè)序法測(cè)定小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌

選取在4 ℃貯藏0 d（鮮樣期）、8 d（腐敗初期）、12 d（腐敗中期）、16 d（腐敗末期）的小龍蝦，取蝦肉進(jìn)行制樣，得到菌懸液。提取樣品菌懸液的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將檢測(cè)合格后的DNA樣品送至上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，采用Origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小龍蝦4 ℃貯藏期間菌落總數(shù)及TVB-N含量變化

小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。下同。

水產(chǎn)品及肉類食物容易在微生物及酶的作用下發(fā)生蛋白質(zhì)分解、脂質(zhì)氧化等生化反應(yīng)，進(jìn)而引起腐敗變質(zhì)[19]。

因此可以通過(guò)測(cè)定小龍蝦肉中的菌落總數(shù)來(lái)初步判斷小龍蝦被細(xì)菌污染及腐敗的程度[20]，反映蝦的品質(zhì)[21-22]。

由圖1可知，小龍蝦在4 ℃貯藏過(guò)程中的菌落總數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，貯藏0～2 d，其增長(zhǎng)趨勢(shì)比較緩慢，說(shuō)明小龍蝦并沒(méi)有發(fā)生明顯的腐敗。而貯藏2～10 d，菌落總數(shù)急劇增加，說(shuō)明小龍蝦在這個(gè)過(guò)程中發(fā)生嚴(yán)重腐敗。貯藏6 d左右，小龍蝦菌落總數(shù)超過(guò)無(wú)公害水產(chǎn)品安全限值（6.0（lg（CFU/g））），表明此時(shí)小龍蝦腐敗嚴(yán)重，到達(dá)了其貨架期的終點(diǎn)。江楊陽(yáng)等[23]

對(duì)江蘇盱眙產(chǎn)地小龍蝦研究發(fā)現(xiàn)，菌落總數(shù)也在6 d超過(guò)

6.0（lg（CFU/g））。除此之外，Li Yan等[24]發(fā)現(xiàn)，南美白對(duì)蝦同樣在貯藏6 d菌落總數(shù)超過(guò)了限值。本實(shí)驗(yàn)中的小龍蝦在貯藏10 d之后，菌落總數(shù)不再明顯增長(zhǎng)，逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。

TVB-N是在微生物和酶的雙重作用下分解蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)產(chǎn)生的生物胺、氨等揮發(fā)性堿性代謝物質(zhì)的總稱[25]，其含量是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品及肉類品質(zhì)最重要的指標(biāo)，是判斷水產(chǎn)品新鮮程度及是否腐敗變質(zhì)的重要因素[26]。由圖2可知，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，TVB-N含量整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，前期增長(zhǎng)比較緩慢，在貯藏后期隨著菌落總數(shù)的快速增長(zhǎng)、腐敗加劇，導(dǎo)致了TVB-N含量增加速率加快[27]。

小龍蝦TVB-N含量在貯藏6 d時(shí)已達(dá)43.28 mg/100 g，與秦求思等[28]測(cè)得的4 ℃貯藏6 d的鷹爪蝦TVB-N含量相近，超過(guò)GB 10136—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性水產(chǎn)制品》中所規(guī)定的淡水水產(chǎn)品TVB-N含量限定值30 mg/100 g，并且伴隨強(qiáng)烈的動(dòng)物腐爛的氨臭味。這與小龍蝦菌落總數(shù)超過(guò)限值的貯藏時(shí)間相一致，表明TVB-N含量變化與菌落總數(shù)密切相關(guān)，結(jié)合2 個(gè)指標(biāo)結(jié)果綜合分析得出，小龍蝦在貯藏6 d時(shí)已經(jīng)腐敗。

2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌單菌落的分離

選擇在4 ℃貯藏至腐敗的小龍蝦進(jìn)行平板涂布、劃線，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色差異在5 種固體培養(yǎng)基上分離純化出10 株細(xì)菌，編號(hào)依次為B1～B10。10 株細(xì)菌菌落形態(tài)及顏色具體見表1。

2.3 腐敗菌菌種的鑒定

2.3.1 腐敗菌菌株分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株B1～B10進(jìn)行16S rDNA測(cè)序后，登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，并選取Max ident在98%以上的菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）及測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果，將B5、B6、B7、B9及B10細(xì)菌定種，分別為中間氣單胞菌（Aeromonas media）、巨型球菌（Macrococcus caseolyticus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）及缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）。

2.3.2 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

根據(jù)測(cè)序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹已對(duì)部分菌株定種，對(duì)仍無(wú)法定種的幾種腐敗菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，最終確定菌株B1～B4及B8的種類，分別為普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。

2.4 4 ℃貯藏小龍蝦高通量測(cè)序結(jié)果分析

2.4.1 小龍蝦4 ℃貯藏期間微生物群落的α-多樣性

α-多樣性分析可以反映小龍蝦樣品中微生物的多樣性（豐富度及均勻度），由多種指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，主要包括反映微生物群落豐富度的Ace指數(shù)、Chao 1指數(shù)和Richness指數(shù)，可以體現(xiàn)微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，以及覆蓋率[29]。

由表3可知，Ace指數(shù)、Chao 1指數(shù)及Richness指數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減小，這說(shuō)明小龍蝦樣品在貯藏過(guò)程中微生物群落豐富度不斷降低，微生物群落中物種種類逐漸減少，出現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)菌屬。而代表樣品中微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也均降低，表示貯藏過(guò)程中小龍蝦樣品的微生物多樣性也在逐步降低[30]，物種均勻度下降。說(shuō)明在小龍蝦貯藏后期，出現(xiàn)了在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌，并且這些細(xì)菌可能抑制了其他種類細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而降低了微生物群落的多樣性。

稀釋曲線體現(xiàn)對(duì)小龍蝦樣本的取樣深度，可以用來(lái)評(píng)估測(cè)序量的合理性[31]。由圖4A可知，隨著測(cè)序深度的增加，小龍蝦稀釋曲線逐漸平緩，說(shuō)明測(cè)序量足夠且充分，測(cè)序樣本能夠合理反映樣品中物種信息。由圖4B可知，Shannon指數(shù)曲線也逐漸趨向平緩，代表微生物多樣性不會(huì)再增加。同時(shí)表3中覆蓋率均大于99%，因此，上述數(shù)據(jù)可以證明小龍蝦樣本的高通量測(cè)序數(shù)量合理，且能夠正確反映出小龍蝦樣品中微生物的多樣性及豐富度。FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

2.4.2 小龍蝦4 ℃貯藏期間細(xì)菌群落的β-多樣性

對(duì)4 ℃貯藏小龍蝦細(xì)菌群落進(jìn)行基于操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）的主成分分析（principal component analysis，PCA），PCA是通過(guò)降維處理展現(xiàn)樣本特定距離的分布方法，PCA圖中不同樣品間距離的遠(yuǎn)近可以反映不同樣本相似性的大小[32-33]。由圖5可知，PC1、PC2的解釋度分別為68.08%和20.03%。從樣品分布可以看出，貯藏0 d樣本與貯藏16 d的樣本距離最遠(yuǎn)，說(shuō)明其菌群組成差異最大。相對(duì)而言，貯藏8、12、16 d的樣本則較為聚集，表示雖然這些樣本之間存在一定的差異，但其菌群結(jié)構(gòu)還是具有較高的相似度，而貯藏12 d與16 d樣本距離最小，說(shuō)明二者菌群結(jié)構(gòu)相似度最高。小龍蝦細(xì)菌菌群β-多樣性的分析結(jié)果顯示，小龍蝦中微生物結(jié)構(gòu)在貯藏過(guò)程中不斷發(fā)生變化，最終造成鮮樣期小龍蝦與腐敗末期小龍蝦微生物結(jié)構(gòu)之間產(chǎn)生較大的差異。

2.5 小龍蝦貯藏期間微生物物種組成及聚類分析

對(duì)測(cè)序得到的序列進(jìn)行聚類分析，以98%以上的序列聚類成OTU，并根據(jù)不同貯藏時(shí)間小龍蝦樣本所對(duì)應(yīng)的OTU繪制維恩圖。由圖6可知，貯藏0、8、12、16 d樣品含有的OTU數(shù)分別為2 830、1 379、1 121和977。貯藏12 d（腐敗中期）與16 d（腐敗末期）樣品中相同的OTU數(shù)為674，高出貯藏0 d（鮮樣期）與16 d（腐敗末期）樣品約500，因此可以說(shuō)明腐敗中期與腐敗末期的小龍蝦樣品微生物物種相似度更高。

由圖7可知，從整體上看，小龍蝦樣品中物種組成差異較大。總共涉及到17 個(gè)菌屬，包括氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）、黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）、變形桿菌屬（Proteus sp.）、

不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactor sp.）、叢毛單胞菌屬（Comamonas sp.）、漫游球菌屬（Vagococcus sp.）等，高通量測(cè)序法除傳統(tǒng)培養(yǎng)法篩選到的10 株細(xì)菌外還鑒定出黃桿菌屬、叢毛單胞菌屬和漫游球菌屬等7 個(gè)菌屬，體現(xiàn)了高通量測(cè)序法的準(zhǔn)確性及全面性。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，小龍蝦鮮樣期相對(duì)豐度較大的細(xì)菌，如叢毛單胞菌屬、漫游球菌屬逐漸減少，而氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬相對(duì)豐度則逐漸增加并成為優(yōu)勢(shì)菌群。在鮮樣期（0 d），氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬相對(duì)豐度分別為1.40%、0.82%。而隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其相對(duì)豐度迅速增大，在貯藏末期（16 d），2 種細(xì)菌的相對(duì)豐度分別達(dá)到38.7%、18.9%。結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)法在小龍蝦中篩菌結(jié)果可知，本實(shí)驗(yàn)中小龍蝦樣品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為氣單胞菌及希瓦氏菌。黃佳奇[34]發(fā)現(xiàn)，冷藏小黃魚的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為變形桿菌及希瓦氏菌，而朱素芹等[35]在凡納濱對(duì)蝦中篩選得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌則為希瓦氏菌及不動(dòng)桿菌，與本研究中產(chǎn)自武漢孝感的4 ℃貯藏小龍蝦中篩選分離得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌及氣單胞菌有所差異，可能是由于不同品種的水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌有所差異。而本研究?jī)?yōu)勢(shì)腐敗菌種類與先前研究得出的小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌、肉食桿菌[23]、陰溝腸桿菌[36]的結(jié)論也稍有不同，這說(shuō)明即使是同一種水產(chǎn)品，其優(yōu)勢(shì)腐敗菌也會(huì)因產(chǎn)地和貯藏溫度的影響而發(fā)生變化。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)產(chǎn)地為武漢孝感的冷藏小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行篩選鑒定，并對(duì)小龍蝦貯藏過(guò)程中微生物結(jié)構(gòu)變化及多樣性進(jìn)行分析。傳統(tǒng)培養(yǎng)法從冷藏小龍蝦中共篩選出維氏氣單胞菌、波羅的海希瓦氏菌、普通變形桿菌等10 株細(xì)菌，結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果，最終確定小龍蝦中主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌為氣單胞菌屬和希瓦氏菌屬。同時(shí)，高通量測(cè)序結(jié)果表明，小龍蝦在貯藏過(guò)程中微生物結(jié)構(gòu)一直在變化。某些細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，如在鮮樣期（0 d）小龍蝦中相對(duì)豐度較大的細(xì)菌叢毛單胞菌屬在腐敗末期小龍蝦中相對(duì)豐度小于1%。而氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬相對(duì)豐度在貯藏過(guò)程中一直增大，并最終占據(jù)腐敗小龍蝦中微生物的主導(dǎo)地位。在腐敗末期，氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬、變形桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、巨球菌屬6 種菌屬的總相對(duì)含量為85%以上。α-多樣性分析表明，小龍蝦鮮樣期OTU數(shù)量最多，菌群群落結(jié)構(gòu)豐富度、多樣性及均勻度最高。而隨著貯藏時(shí)間的增長(zhǎng)，多樣性、豐富度及均勻度都在下降，尤其是在腐敗末期到達(dá)最低，這可能與優(yōu)勢(shì)腐敗菌的大量繁殖及繁殖過(guò)程中對(duì)其他細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制有關(guān)。β-多樣性分析則表明，鮮樣期與腐敗末期菌群結(jié)構(gòu)差異較大，而腐敗中期與腐敗末期差異較小，這與α-多樣性分析結(jié)果相一致。對(duì)冷藏小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選鑒定、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析，為今后利用保鮮技術(shù)靶向殺滅腐敗菌、延長(zhǎng)貨架期、降低經(jīng)濟(jì)損失提供了一定的理論參考，同時(shí)也為今后開發(fā)新的小龍蝦品質(zhì)安全檢測(cè)及保鮮殺菌技術(shù)提供了思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張澤偉， 段偉文， 陳銘， 等. 過(guò)熱蒸汽對(duì)熟制小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的殺菌動(dòng)力學(xué)及其機(jī)理[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2020， 40（1）： 87-96. DOI：10.3969/j.issn.1673-9159.2020.01.012.

[2] 王順昌. 克氏螯蝦的生物學(xué)和生態(tài)養(yǎng)殖模式[J]. 淡水漁業(yè)， 2003， 33（4）： 59-61. DOI：10.3969/j.issn.1000-6907.2003.04.023.

[3] 吳晨燕， 王曉艷， 王洋， 等. 熟制麻辣小龍蝦冷藏和凍藏條件下的品質(zhì)變化[J]. 肉類研究， 2018， 32（5）： 52-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805009.

[4] 徐永霞， 白旭婷， 趙洪雷， 等. 植物乳桿菌在水產(chǎn)品中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)調(diào)味品， 2022， 47（2）： 195-199. DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2022.02.040.FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

[5] BRIONES L S， REYES J E， TABILO-MUNIZAGA G E， et al. Microbial shelf-life extension of chilled Coho salmon （Oncorhynchus kisutch） and abalone （Haliotis rufescens） by high hydrostatic pressure treatment[J]. Food Control， 2010， 21（11）： 1530-1535. DOI：10.1016/j.foodcont.2010.04.027.

[6] ODUNAYO O O， SOOTTAWAT B. Natural preservatives for extending the shelf-life of seafood： a revisit[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety， 2018， 17（6）： 1595-1612. DOI：10.1111/1541-4337.12390.

[7] LUO Zisheng， XU Yanqun， YE Qingyang. Effect of nano-SiO2-LDPE packaging on biochemical， sensory， and microbiological quality of Pacific white shrimp Penaeus vannamei during chilled storage[J]. Fisheries Science， 2015， 81（5）： 983-993. DOI：10.1007/s12562-015-0914-3.

[8] HUANG Wanyou， JI Hongwu， LIU Shucheng， et al. Inactivation effects and kinetics of polyphenol oxidase from Litopenaeus vannamei by ultra-high pressure and heat[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2014， 26： 108-115. DOI：10.1016/j.ifset.2014.10.005.

[9] GRAM L， DALGAARD P. Fish spoilage bacteria-problems and solutions： a review[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2002， 3（13）： 262-266. DOI：10.1016/S0958-1669（02）00309-9.

[10] 于淑池， 楊毅， 馮紫藍(lán)， 等. 冷藏卵形鯧優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定及致腐能力分析[J]. 食品工業(yè)科技， 2021， 42（1）： 101-109. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020030307.

[11] LEROI F， CORNET J， CHEVALIER F， et al. Selection of bioprotective cultures for preventing cold-smoked salmon spoilage[J]. International Journal of Food Microbiology， 2015， 213： 79-87. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2015.05.005.

[12] 謝麗丹， 李蕾蕾， 王素英， 等. 低溫貯藏南美白對(duì)蝦特定腐敗菌的分離鑒定及腐敗能力分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2016， 42（3）： 67-72. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603012.

[13] 丁婉. 半干草魚片貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的研究[D]. 長(zhǎng)沙： 中南林業(yè)科技大學(xué)， 2016： 50-60.

[14] 任陽(yáng)陽(yáng). 鰱魚卵類Cystatin的鑒定及其對(duì)冷藏鰱魚肉片中假單胞菌J-4的抑制作用研究[D]. 成都： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013： 50.

[15] 劉愛芳， 謝晶， 錢韻芳. 冷藏金槍魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐敗能力[J]. 食品科學(xué)， 2018， 39（3）： 7-14. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201803002.

[16] OLAFSDOTTIR G， LAUZON H L， MARTINSDOTTIR E. Influence of storage temperature on microbial spoilage characteristics of haddock fillets （Melanogrammus aeglefinus） evaluated by multivariate quality prediction[J]. International Journal of Food Microbiology， 2006， 111（2）： 112-125. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2006.04.045.

[17] 高乾坤， 焦琳舒， 杜賀超， 等. 高通量測(cè)序分析不同產(chǎn)地帶魚冷藏時(shí)微生物群落多樣性[J]. 食品科學(xué)， 2018， 39（18）： 127-132. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201818020.

[18] 曹榮， 劉淇， 趙玲， 等. 基于高通量測(cè)序的牡蠣冷藏過(guò)程中微生物群落分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)， 2016， 32（20）： 275-280. DOI：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.20.036.FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

[19] 孔金花， 溫麗敏， 諸永志， 等. 高溫熟制殺菌對(duì)小龍蝦品質(zhì)及貯藏特性的影響[J]. 肉類研究， 2022， 36（3）： 38-44. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211210-236.

[20] 于曉慧， 葛孟甜， 林琳， 等. 一株常溫保藏即食小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離及鑒定[J]. 肉類工業(yè)， 2018（5）： 33-38.

[21] EMBORG J， LAURSEN B G， DALGAARD P. Significant histamine formation in tuna （Thunnus albacares） at 2 ℃-effect of vacuum-and modified atmosphere-packaging on psychrotolerant bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology， 2005， 101（3）： 263-279. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2004.12.001.

[22] 徐麗敏， 薛長(zhǎng)湖， 李兆杰， 等. 水溶性殼聚糖對(duì)南美白對(duì)蝦品質(zhì)及腐敗菌相變化的影響[J]. 食品工業(yè)科技， 2008（6）： 107-110. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2008.06.030.

[23] 江楊陽(yáng)， 楊水兵， 余海霞， 等. 基于培養(yǎng)基法和高通量測(cè)序法分析冷藏小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌[J]. 食品科學(xué)， 2019， 40（16）： 130-136. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20180718-229.

[24] LI Yan， LEI Yutian， TAN Yuqing， et al. Efficacy of freeze-chilled storage combined with tea polyphenol for controlling melanosis， quality deterioration， and spoilage bacterial growth of Pacific white shrimp （Litopenaeus vannamei）[J]. Food Chemistry， 2022， 370： 130924. DOI：10.1016/j.foodchem.2021.130924.

[25] 吳湛霞， 潘江球， 楊子明， 等. 混合分子質(zhì)量殼聚糖結(jié)合臭氧殺菌處理對(duì)羅非魚片的冷藏保鮮作用[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 36（3）： 71-75. DOI：10.3969/j.issn.1673-9159.2016.03.012.

[26] 許振偉， 李學(xué)英， 楊憲時(shí)， 等. 冷藏鯉魚和羅非魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗能力分析[J]. 食品科學(xué)， 2012， 33（4）： 243-246.

[27] ALPARSLAN Y， YAPICI H H， METIN C， et al. Quality assessment of shrimps preserved with orange leaf essential oil incorporated gelatin[J]. LWT-Food Science and Technology， 2016， 72： 457-466. DOI：10.1016/j.lwt.2016.04.066.

[28] 秦求思， 李思敏， 孟粉， 等. 基于鮮度的動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)鷹爪蝦剩余貨架期[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2021， 21（7）： 259-266. DOI：10.16429/j.1009-7848.2021.07.031.

[29] AMATO K R， YEOMAN C J， KENT A， et al. Habitat degradation impacts black howler monkey （Alouatta pigra） gastrointestinal microbiomes[J]. The ISME Journal， 2013， 7（7）： 1344-1353. DOI：10.1038/ismej.2013.16.

[30] 徐圓程， 劉慧， 王光宇， 等. 基于高通量測(cè)序分析儲(chǔ)藏稻谷中的真菌群落結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢(shì)菌屬[J]. 食品科學(xué)， 2021， 42（24）： 92-99. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20201014-122.

[31] JESPERSEN L， JAKOBSEN M. Specific spoilage organisms in breweries and laboratory media for their detection[J]. International Journal of Food Microbiology， 1996， 33（1）： 139-155. DOI：10.1016/0168-1605（96）01154-3.

[32] NELSON M C， MORRISON H G， BENJAMINO J， et al. Analysis， optimization and verification of Illumina-generated 16S rRNA gene amplicon surveys[J]. PLoS ONE， 2014， 9（4）： e94249. DOI：10.1371/journal.pone.0094249.

[33] 龐春霞， 李藝， 虞任瑩， 等. 基于Illumina Miseq技術(shù)比較不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵大豆制品細(xì)菌多樣性[J]. 食品工業(yè)科技， 2022， 43（8）： 133-140.

DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2021070215.

[34] 黃佳奇. 小黃魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定及其與品質(zhì)的相關(guān)性研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2018： 24-26.

[35] 朱素芹， 張軍寧， 曾惠， 等. 凡納濱對(duì)蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌鑒定及其致腐能力的初步研究[J]. 食品科技， 2012， 37（1）： 36-40. DOI：10.13684/j.cnki.spkj.2012.01.032.

[36] 鄧靈， 趙康， 夏開， 等. 小龍蝦（Procambarus clarkii）加工前后優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離與鑒定[J]. 食品工業(yè)科技， 2020， 41（18）： 100-104. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020.18.016.

收稿日期：2022-05-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-48）

第一作者簡(jiǎn)介：孟凌云（1998—）（ORCID： 0000-0003-3185-2743），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及貯藏。

E-mail： mengly629@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：李嬌（1992—）（ORCID： 0000-0002-6058-3725），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及貯藏。

E-mail： lijiao@ouc.edu.cnFE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE