胃癌類器官在精準醫學研究中的應用

鞏淼淼, 周麗桂, 趙菊梅, 師長宏

(1. 延安大學醫學院,延安 716000; 2. 空軍軍醫大學實驗動物中心,西安 710032; 3. 廣州中醫藥大學實驗動物中心,廣州 510405)

胃癌（gastric cancer）在全球癌癥發病率中位居第五，是全球第四大癌癥死亡原因［1］。我國胃癌的發病率較高，占全球胃癌患者總數的44.21%，且患者從發病到死亡所損失的全部健康壽命年即傷殘調整生命年（disablility adjusted life year，DALYs） 從1990 年 到2019 年增加了19.11%［1-2］。目前胃癌的治療方式主要包括手術和藥物治療，不幸的是大多數患者都會出現耐藥反應。

在過去的幾十年里，研究人員在大量抗癌藥物的篩選和臨床前藥物研發過程中采用到多種重要的模型［3-6］，例如二維（2D）標準細胞系模型、胃癌腫瘤發生的基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse models，GEMM）、人源腫瘤細胞系移植模型（cell derived xenograft，CDX）和人源腫瘤組織異種移植模型（patient derived xenograft，PDX），這些模型盡管在胃癌發病機制和藥物研究中發揮了一定的作用，然而因其均不能很好地表達腫瘤相關遺傳背景和異質性，導致大多數藥物在臨床研究中都失?。?-8］，研究結果的臨床應用價值有限。

近年來，患者來源腫瘤類器官（patient-derived organoid，PDO）因更接近其來源組織的生理結構，保留來源組織的特定功能，并且可以得到與臨床患者更加相似的藥物反應，因此進入研究人員的視野。大量研究表明，PDO 模型可以有效評估癌癥患者的特異性反應［9-12］，同時與患者個體化治療的結果有很高的相似性［13］。由此可見，PDO模型可作為臨床前藥物篩選的理想模型，替代繁瑣的動物體內實驗研究，這對胃癌患者的個性化治療和精準醫學研究有著重要的意義。

1 胃癌類器官模型建立情況

1.1 胃癌類器官模型的發展概況

胃類器官大多通過成人胃干細胞擴增和人功能干細胞（pluripotent stem cells，PSCs）的定向分化來建立。首例胃類器官是在2010年利用多功能干細胞建立的［14］，之后人類開始嘗試利用患者來源的組織建立胃癌類器官［10］。有研究者報告，胃癌類器官建立成功率在50%～74%［15-16］。也有報告，胃癌患者大多都會做食道、胃、十二指腸鏡檢查（esophagogastroduodenoscopy，EGD），從而可以利用活檢組織建立充足的胃癌類器官［17］。研究已證實，胃癌類器官的建立率在組織病理學亞型之間沒有顯著差異［16］。

2020年日本研究者先建立起10例來源于患者的胃癌類器官，從中選取了對5-氟尿嘧啶相對敏感的4例［18］，接著不斷對建立起來的胃癌類器官用不同濃度的5-氟尿嘧啶進行處理，成功建立起對5-氟尿嘧啶有耐藥性的類器官模型，發現KHDRBS3與藥物治療的耐藥性有關。Loryn 等［19］為了研究幽門螺桿菌誘導胃上皮細胞程序性死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）表達的機制，將患者來源的類器官和自體免疫細胞共培養，建立了一個體外模型來研究胃上皮細胞和T 淋巴細胞之間的相互作用以應對感染，發現感染幽門螺桿菌的胃上皮高表達PD-L1，并抑制細胞毒性T 淋巴細胞的增殖，這表明感染了表達PD-L1 的幽門螺桿菌的胃上皮細胞受到保護，進而免除了免疫反應的影響，導致癌前病變發展為胃癌。Dani 等［20］發現，Troy+細胞是一種完全分化的細胞，具有充當多能干細胞的能力，同時證明了單個Troy+主細胞可以形成胃類器官。有研究者用Troy 作標志物來驗證胃癌類器官［21］，結果表明可以通過檢測Troy來確定是否為胃癌類器官。

除此之外，胃癌轉移性標本的類器官模型也被建立起來。例如Georgios等［9］建立了來自參與Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗的新鮮活組織檢查的轉移性胃腸癌患者的PDO生物庫，并通過識別類器官中的基因型-藥物表型相關性，將這些癌癥類器官的藥物反應與實際患者的反應進行了比較，證明類器官模型可預測轉移性胃腸癌患者對治療的反應。李杰等［22］建立了胃癌惡性腹腔積液衍生類器官（malignant ascites derived organoid，MADO）的集合，成功率為92%，而且經過傳代，其形態和基因組沒有任何變化，可以對常規化療藥物的多藥耐藥性進行篩選。

1.2 胃癌類器官模型的組織學特征和分子分型

胃癌分類方法大體有兩種。一種是組織形態學分類系統：按照通用的Lauren 分類法，將胃癌分為腸型胃癌和彌漫型胃癌兩種組織學亞型［23］；另外世界衛生組織還提出另一種組織分類方法，將胃癌分為乳頭狀癌、管狀癌、黏液癌（膠體癌）和低黏附性癌［24］。雖然組織形態學分類系統在臨床上具有通用性和廣泛的應用，但不足以反映胃癌的分子和遺傳特征，也不足以在精確醫學時代制定個性化的治療策略。另一種是分子分類系統，通過基因組技術和高通量分析進一步對胃癌進行分類。2014 年TCGA 研究網絡組將胃癌分為4 種遺傳亞型：EB 病毒（epstein-barr virus，EBV）陽性型、微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）型、染色體不穩定（chromosomal instability，CIN）型和基因組穩定（genome stable，GS）型［25］。大多數腸道和彌漫性胃癌的組織學亞型分別屬于CIN 和GS 亞型［25］，這種分型是目前應用最多的分子分型。

依據胃癌的組織學特征和TCGA 分類的分子分型可建立比較精準的胃癌類器官。例如，Therese 等［10］建立了20種人胃癌類器官，選擇了4種進行全面分析，使用全基因組測序對類器官與胃癌分子亞型進行了相匹配，其中1例與GS亞型相匹配，1例與CIN亞型相匹配，2例與MSI亞型相匹配。按照分子分型建立起類器官后可進行一系列基因層面的研究，這將有助于推動胃癌精準醫學和個性化治療的研究［10，15，26］。

1.3 胃癌類器官的優點和不足

胃癌PDO 模型與傳統細胞系、CDX、PDX、GEMM 相比較，具有顯著的優勢（表1）。胃癌PDO 一般3 d 左右可進行一次傳代［10］，與動物模型相比，可以快速地高通量篩選［15］。由于PDO 直接來源于患者，與傳統細胞系相比，具有很高的臨床相關性，并用于個性化治療［13］；在基因編輯方面，PDO 同樣可以滿足［27］。但類器官大多數以上皮細胞為主，缺少研究上皮細胞和非上皮細胞之間持續的相互作用，與動物模型相比，在腫瘤微環境相關研究中存在劣勢（表1）；但這一局限性正在通過培養方法的改變來改善，例如將人工生長因子梯度作用于類器官［28］、免疫細胞共培養方法［19］和氣液界面交換法［29］?？傊惼鞴倌Ｐ驮谀[瘤研究中具有廣闊的應用前景。

表1 不同胃癌模型的比較Table 1 Comparison of different models of gastric cancer

2 胃癌類器官在精準醫學研究中的應用

目前，盡管已經廣泛開展針對癌癥患者基因型特征的精準醫學研究，用于促進癌癥治療并改善患者預后［30］。然而，由于人類腫瘤細胞的分子異質性和可塑性，基于基因型的癌癥治療預測并不明確，這為個性化精準醫學研究提出了新的挑戰。隨著類器官模型的藥物試驗成功，為個性化精準醫學這一問題的解決提供了新的手段。比如，可以先建立胃癌類器官模型，然后對腫瘤組織進行分類分型，可利用基因測序技術獲得驅動基因，之后再用類器官對關鍵驅動基因的捕獲找到相關靶點，通過腫瘤藥物資料庫對藥物進行篩選和預測，也可與成簇的規律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，

CRISPR）/CRISPR 相 關 蛋 白 核 酸 酶9 （CRISPRassociated nuclease 9，Cas9）技術、幽門螺桿菌感染相結合，最后進行匹配，找到個性化治療策略。總之，將基因組數據與患者腫瘤樣本的藥物篩選相結合，可確定針對不同患者的個體化治療方案（圖1）。

圖1 類器官在精準醫學研究中的應用策略Figure 1 Application strategy of organoid in precision medicine research

2.1 研究生態位因子對胃癌產生的影響

胃癌類器官的培養離不開干細胞“生態位（Niche）因子”的特殊組合，即Wnt 激活劑（Wnt-3A和R-spondin）、受體酪氨酸激酶配體［表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）10］、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP） 抑制劑（Noggin）和轉化生長因子-β （transforming growth factor beta，TGF-β）抑制劑（A83-01）［14，31］。研究生態位因子對胃癌產生的影響時，類器官模型無疑是一種好的選擇。

Nanki等［16］利用胃癌患者組織細胞建立類器官生物標本庫來研究胃癌的發生發展分子機制，利用CRISPR-Cas9 技術對類器官進行基因編輯，再通過生態位因子依賴與基因突變來進一步研究胃癌中的基因型-表型相關性。將建立的胃癌類器官分為EGF 依賴，EGF 非依賴以及EGFR 抑制劑抵抗等，發現ERBB3 或PTEN突變的胃癌類器官依賴于生長因子EGF 和FGF，但ERBB2和ERBB3擴增的胃癌類器官不再依賴EGF和FGF。同時發現了腫瘤激活Wnt 通路的多種途徑，之后通過胃癌類器官的異種移植進一步確定了Wnt 靶向治療Wnt依賴性胃癌的可行性［16］。

2.2 探索胃癌發生的關鍵驅動基因

目前關于胃癌具體的發病機制仍不明確，需要對其進行多方面的探索，也有研究者通過建立捕獲關鍵驅動基因的模型對其機制進行研究。例如，香港大學研究者建立了一個原發性胃癌類器官生物標本庫，包括17 個正常胃類器官和46 個胃癌類器官［15］。分析了大多數已知的分子亞型，包含EBV、MSI、腸型/CIN和彌 漫 型/GS， 具 有CLDN18-ARHGAP6 或CTNND1-ARHGAP26融合或RHOA突變，并獲取了胃癌的異質性和遺傳特征。此外，該團隊也通過類器官進行了藥物敏感性的測試。

此外，胃癌類器官與關鍵驅動基因相結合，可以進一步推動精準醫學的研究。Lincoln 等［32］發現胃癌原發腫瘤FGF受體2（FGF receptor 2，FGFR2）基因擴增，但轉移瘤并不表現FGFR2擴增，而是具有TGF-β受體2（TGF-β receptor 2，TGFBR2）獨特雙等位基因的改變；之后在體細胞CDH1 和TP53 突變的類器官背景下，將類器官中的TGFBR2 敲低，發現類器官中存在發育異常且具有侵襲性；同時進行體內實驗以驗證TGFBR2是否有潛在轉移，結果表明TGFBR2是彌漫型胃癌的驅動突變基因，解決了尋找彌漫性胃癌轉移的遺傳驅動因素的問題。以上研究均表明，類器官可以通過不同的方法對胃癌機制進行探索，并找到相應的靶點為下一步研究提供幫助。

2.3 揭示幽門螺桿菌感染在胃癌發生中的作用

幽門螺桿菌感染是導致胃癌發生的首要獨立危險因素［33］。關于幽門螺桿菌的模型在體內體外均有研究，其中類器官模型是近期最受關注的模型之一［34］。相關研究表明，類器官為評估癌細胞與癌相關成纖維細胞［35］或病原體［36-37］的共培養系統提供了一種理想的方法。將幽門螺桿菌感染的人胃類器官與宿主免疫細胞共培養，發現感染了表達PD-L1 的幽門螺桿菌的細胞受到保護，可能會免受免疫反應的影響［19］。

研究表明，類器官模型在研究幽門螺桿菌和胃癌的發生發展機制中發揮著重要作用。有研究者在幽門螺桿菌感染的胃類器官中觀察到NF-κB信號的強烈激活和胃上皮細胞增殖的增強，這是幽門螺桿菌感染的標志，從而驗證了在傳統細胞培養中幽門螺桿菌感染的潛在機制［31，38-39］。也有研究者將3D 原代類器官培養物通過球體剪切的方法，接種到膠原涂層孔中轉化成2D 培養物，利用3D 類器官作為無限細胞源，在2D培養物中能夠概括幽門螺桿菌的主要特征和發病機制，包括“蜂鳥”-表型、細胞空泡化和CagA 磷酸化。相比于3D 培養物，轉化為2D 培養物更容易處理，并可以提供可靠的感染條件［36］。但目前這些方法大多用于基礎研究，相信隨著類器官技術的成熟，將來可用于疾病階段的診斷和藥物篩選，為個性化治療應用提供幫助。

2.4 高通量藥物篩選

類器官是預測藥物療效和藥物發現的新型工具，適用于高通量藥物篩選。腫瘤類器官已經作為藥物發現的臨床前癌癥模型，在預測胃癌患者靶向治療效果方面有著巨大的潛力［40］。目前針對類器官進行的研究大多數都是基于形態學、熒光讀數或基于ATP 的細胞活力的測定。腫瘤類器官的藥物篩選方案一般是將腫瘤類器官種植在384孔板或96孔板中并用藥物處理3～6 d，然后根據CellTiter-Glo?測試類器官的活性［41］。Therese 等［10］將胃癌類器官暴露于5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康、多西他賽和表柔比星，并記錄了每種藥物的不同反應，發現顯示ERBB2 基因擴增的1 例PDO 僅在高濃度時對5-氟尿嘧啶顯示出反應，且對除伊立替康以外的大多數應用藥物顯示出抗性；該研究還建立了代表人類胃癌典型特征和改變途徑的人和小鼠癌癥類器官，證明了類器官在測試個體患者的治療反應和耐藥性方面具有潛在用途。

此外，也可創建胃癌轉移的相關類器官模型進行藥物篩選。Georgios 等［9］用轉移性癌癥類器官進行了藥物篩選，用Ⅰ-Ⅲ期臨床試驗或臨床實踐中的55 種藥物庫進行了為期兩周的篩選分析，結果驗證了使用來自轉移性癌癥的PDO 作為藥物篩選工具的可行性。李杰等［22］用惡性腹腔積液腫瘤細胞建立了11 個胃癌轉移的MADO（惡性腹腔積液是晚期胃癌常見的常見癥狀），用奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶、順鉑、多西他賽、伊立替康、表柔比星和紫杉醇對MADO進行藥物篩選，每種藥物以6 個不同濃度對MADO 進行作用，測試藥物的半數抑制濃度，判斷藥物的敏感性。結果顯示，對于胃癌惡性腹腔積液和胃癌轉移性疾病都能成功地用類器官進行藥物篩選。用類器官進行體外藥物實驗將縮短藥物研究的成本，能夠個性化篩選有效的藥物。

2.5 替代動物體內實驗預測胃癌患者的臨床反應和預后

體外類器官的藥物敏感性或耐藥性測試是否可以真正代表患者的結果，需要將臨床前模型中的藥物反應與患者的實際反應進行比較。在2019年發表的一項研究中，首次在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中招募轉移性結直腸癌和胃食管癌患者，對他們建立相應的PDO 生物庫，研究證明類器官在個性化醫療中的預測價值［9］。這為利用類器官開展胃癌患者藥物敏感性測試提供了依據。

Georgios 等［9］用類器官在21例胃癌患者的臨床反應中測試了它們的臨床預測價值，比較了紫杉醇敏感的胃癌患者治療前后建立的連續類器官與兩名紫杉醇耐藥的肝轉移胃癌患者的類器官對紫杉醇的反應，從紫杉醇濃度和細胞周期中分析，發現耐藥性類器官和紫杉醇難治性類器官表現出相同的劑量反應曲線，紫杉醇治療后出現顯著的細胞凋亡，與臨床觀察到的結果一致。最終得出類器官預測患者對靶向藥物或化療的反應敏感性為100%，特異性為93%，陽性預測值為88%，陰性預測值為100%［9］。胃癌類器官可幫助預測患者對靶向治療（如HER2抑制）的反應，每個類器官可幫助確定患者對哪種藥物有效或耐藥，甚至對可能引起不良反應或幾乎沒有治療反應的藥物進行預測［13］。

以上結果說明，胃癌類器官可以通過化療藥物的反應來預測患者的預后情況，也可以預測靶向治療效果。類器官值得在癌癥患者的前瞻性臨床試驗中進一步評估，更好地預測化療藥物和靶向治療的成功或失敗，從而進一步開發潛在的藥物。

2.6 實現胃癌患者的個性化治療

每個胃癌患者對相同的治療方案可能有不同的療效，對每種化療藥的耐藥程度也不相同。隨著個性化治療被提出，開發個性化治療需要捕捉腫瘤遺傳異質性的特點［13］。由于類器官具有高保真性和快速建模的特征，胃癌類器官在預測患者的藥物敏感性方面顯示出很高的臨床效用，患者組織來源的類器官模型有助于胃腸癌的個性化治療［42-43］。有研究者把患者來源的類器官直接接種在96孔板上培養，并在患者手術后3 d內對類器官進行藥物測試，依據結果在手術后5～6 d內告知臨床醫生預先的治療方案是否可行［13］。這說明來源于患者的類器官有助于個性化治療的深入研究。

目前有研究者正在對一項人體臨床試驗（OPPOSITE 試驗：NCT03429816［44］）進行評估，用患者來源的胃癌建立類器官，患者與體外建立的類器官將接受相同的新輔助全身治療，體外細胞毒性將與體內反應相關；該研究預計將在2022年完成，目前結果尚不清楚，預計可形成從尋找腫瘤驅動基因到靶向藥物，再到個性化治療的匹配模式。未來胃癌個性化醫療將與臨床緊密結合，可測試各種藥物并預測晚期胃癌個體患者的最佳治療方案。

3 展望

胃癌類器官可預測藥物對患者是否有效，避免抗癌藥物的盲目使用，減少不良反應，提高治療效果。每個疑似胃癌的患者幾乎都會接受EGD 活檢，因此可以從活檢中創建類器官生物樣本庫來豐富人類生物材料，為胃癌的個性化治療提供有效的實驗工具［17］。隨著類器官模型培養技術的不斷完善，有可能替代動物模型在腫瘤研究中發揮重要作用。未來可通過胃癌分子分型和組織表型相結合，精確預測患者的預后，并制定個體化治療方案，即通過規范性、個體化的手術治療聯合放化療、靶向治療和免疫治療，進一步改善胃癌的治療效果，提高胃癌患者治愈率，使更多的胃癌患者獲益。

盡管如此，胃癌類器官模型用于精準化治療仍存在一定的局限性：（1）目前建立的胃癌類器官模型中EBV 亞型比較少見，大部分沒有檢測到這種亞型陽性［10］，少數研究者報告建立的胃癌類器官又可以捕捉到這一亞型［15］；也有研究者表明在胃類器官中EBV亞型不能表達，而在胃癌類器官中可以表達［45］。這可能說明EBV 亞型在胃癌類器官表達中存在一定的不確定性，還需要進一步研究確認。（2）胃癌患者組織來源獲取的細胞量不穩定，這可能與腫瘤組織的狀態和新鮮程度有很大關系，如何獲取最大量的細胞并在基質膠內保留最大活性仍需要進一步探索。隨著實驗技術的不斷改進和相關研究的不斷探索，相信類器官一定會在胃癌臨床應用研究中發揮重要作用。

[作者貢獻Author Contribution]

鞏淼淼負責文獻查閱和整理，以及文章撰寫與修改；周麗桂負責部分文獻資料查閱及討論；趙菊梅提供文章整體內容的修改建議；師長宏對全文內容進行修改指導。

[利益聲明Declaration of interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。