不同方法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的比較研究

盧心鵬, 劉 蓉, 黃文博, 趙 瑾, 李洪濤

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州呼吸健康研究院,廣州 510120)

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）簡稱慢阻肺，是一種氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展的疾病，以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為主要特征。隨著發(fā)達(dá)國家人口老齡化進(jìn)展、發(fā)展中國家吸煙人數(shù)上升和生物燃料污染嚴(yán)重，世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)未來COPD 的發(fā)病率將持續(xù)升高，到2060 年可能將有超過540 萬人/年死于COPD 及相關(guān)疾病［1］。我國COPD 的發(fā)病狀況也相當(dāng)嚴(yán)重，40 歲以上人群COPD的死亡率達(dá)到13.7%［2］。作為一種高致殘率和高病死率的疾病，COPD的防治始終是臨床和基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)之一。建立與臨床患者疾病發(fā)生發(fā)展及病理變化相符合的動物模型，是研究COPD 發(fā)病機(jī)制與治療藥物的基礎(chǔ)。目前建立COPD 動物模型的常見方法有兩種，即煙草煙霧暴露（cigarette smoke exposure，CSE）以及CSE 聯(lián)合細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）暴露（CSE+LPS）［3-5］，但尚未有關(guān)于這兩種方法建立大鼠COPD模型的對比研究報(bào)告。本研究對CSE和CSE聯(lián)合氣道內(nèi)滴注LPS兩種方法建立的大鼠COPD模型進(jìn)行評價(jià)和對比分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

30只SPF級雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量140～160 g，購于浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［SCXK（浙）2019-0001］。大鼠飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心屏障環(huán)境［SYXK（粵）2020-0227］，溫度22～25 ℃，濕度恒定，12 h 日夜交替照明。本實(shí)驗(yàn)所涉及的動物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（No.202040A）。

1.2 主要儀器和試劑

小動物有創(chuàng)肺功能儀（BUXCO，美國），自制小動物密封熏煙箱（規(guī)格為100 cm×60 cm×60 cm），全波長多功能酶標(biāo)儀（Thermo，美國）。紅玫牌香煙（廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，焦油量12 mg，煙堿量1.1 mg，一氧化碳量15 mg），細(xì)菌脂多糖（Sigma，美國），使用時(shí)用生理鹽水（即0.9%NaCl 溶液）配制成1 mg/mL溶 液。大 鼠IL-8 和TNF-ɑ 檢 測 用ELISA 試 劑 盒（R&D，美國）。

1.3 大鼠COPD模型制備

將SD 大鼠隨機(jī)分為對照組、CSE 組和CSE+LPS組，每組10 只。分別采用CSE 法和CSE 聯(lián)合LPS 氣管滴注法制備大鼠COPD模型［6-7］。方法如下：CSE組大鼠置于熏煙箱，點(diǎn)燃10支香煙進(jìn)行煙霧暴露1 h，每天上午和下午各1次，中間間隔6 h；每周熏煙6 d，共24周。CSE+LPS 組大鼠熏煙方式與CSE 組相同，并于第9、10、12周的第一天，將大鼠用2%異氟烷麻醉，固定于自制固定板上，在喉鏡下經(jīng)大鼠氣道滴注LPS，每只大鼠每次給藥0.2 mg/kg；給予LPS 當(dāng)天不熏煙［7-8］。對照組大鼠在正常環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.4 大鼠肺功能指標(biāo)測定

造模結(jié)束后，大鼠按體質(zhì)量給予3%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定行氣管插管，連接小動物有創(chuàng)肺功能儀，測定大鼠有創(chuàng)肺功能指標(biāo)，包括：氣道阻力（airway resistance，RI）、潮氣量（tidal volume，TV）、靜態(tài)肺順應(yīng)性（chord compliance，Cchord）、功能殘氣量（functional residual capacity，F(xiàn)RC）、每分鐘通氣量（minute volume，MV）、第50 ms 用力呼氣容積（forced expiratory volume in 50 ms，F(xiàn)EV50）和用力呼氣容積比（forced vital capacity，F(xiàn)VC）等參數(shù)，計(jì)算FEV50/FVC。

1.5 肺組織病理學(xué)觀察

肺功能測定完成后，打開大鼠胸腔，暴露心臟取血，然后取左肺葉組織，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定24 h 后，常規(guī)依次脫水、石蠟包埋、切成4 μm 的薄片，并用蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡（100倍視野）下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.6 大鼠血清IL-8和TNF-ɑ測定

各組大鼠心臟取血，室溫靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，分離血清。采用ELSIA法以酶標(biāo)儀檢測IL-8、TNF-ɑ水平。具體步驟按照試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析。計(jì)量材料采用±s表示。多組間樣本比較先進(jìn)行單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，組內(nèi)兩組間兩樣本再采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

對照組大鼠精神良好，飲食正常，毛發(fā)有光澤，呼吸平穩(wěn)，無氣促。CSE 組和CSE+LPS 組大鼠在造模期間均出現(xiàn)精神萎靡、咳嗽、氣促、毛發(fā)枯黃等癥狀，而且進(jìn)食飲水量減少。造模結(jié)束后，CSE組和CSE+LPS組大鼠平均體質(zhì)量分別為（524±21）g和（513±14）g，與對照組［（666±19）g］相比有明顯差異（P＜0.05），而CSE組和CSE+LPS組之間無明顯差異，見圖1。

圖1 造模后各組大鼠的體質(zhì)量生長曲線圖Figure 1 Body weight growth curve of rats in each group after modeling

2.2 各組大鼠肺功能參數(shù)比較

大鼠肺功能測定結(jié)果顯示，CSE 組和CSE+LPS 組大鼠的RI、Cchord、FRC 值均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TV、MV、FEV50/FVC均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；和CSE 組 比 較，CSE+ LPS 組 的RI、FRC 值 顯 著 升 高，F(xiàn)EV50/ FVC 顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 造模后各組大鼠的肺功能指標(biāo)Table 1 Lung functions of rats in each group after modeling（±s,n=10）

表1 造模后各組大鼠的肺功能指標(biāo)Table 1 Lung functions of rats in each group after modeling（±s,n=10）

注：Control 指正常環(huán)境下飼養(yǎng)的對照組，CSE 指煙草煙霧暴露組，CSE+LPS 指煙草煙霧暴露聯(lián)合細(xì)菌脂多糖氣道內(nèi)滴注組。RI 即氣道阻力，TV即潮氣量，Cchord即靜態(tài)肺順應(yīng)性，F(xiàn)RC即功能殘氣量，MV即每分鐘通氣量，F(xiàn)EV50/FVC即第50 ms用力呼氣容積和用肺活量之比。★表示與Control組比較，P ＜0.05；#表示與CSE組比較，P ＜0.05。Note：Control，rats in the control group raised in a normal environment；CSE，rats in the cigarette smoke exposure group；CSE+LPS，rats in the intratracheal LPS instillation combined with CSE group. There were 10 rats in each group. RI，airway resistance；TV，tidal volume；Cchord，chord compliance；FRC，functional residual capacity；MV，minute volume；FEV50/FVC，forced expiratory volume in 50 ms VS forced vital capacity. ★Represent significant differences compared to the control group，P ＜0.05；#Represent significant differences compard to the CSE group，P ＜0.05.

Group Control CSE CSE+LPS RI/(cmH2O·s-1·mL-1)0.250±0.026 0.315±0.018★0.348±0.025★#TV/mL 3.90±0.19 3.64±0.10★3.57±0.14★Cchord/(mL·cmH2O-1)1.210±0.042 1.310±0.071★1.395±0.120★FRC/mL 5.29±0.51 5.88±0.59★6.58±0.44★#MV/mL 233.98±11.40 218.72±5.18 214.12±8.60★FEV50/(FVC/%)0.155±0.041 0.118±0.030★0.099±0.035★#

2.3 各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)

HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組織切片肺泡及小氣道周圍炎癥情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔整齊無斷裂；CSE 組大鼠小氣道支氣管壁增厚，氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬且炎性細(xì)胞浸潤，鄰近肺組織、肺泡腔呈代償性擴(kuò)張；CSE+LPS 組大鼠肺組織與CSE 組大鼠類似，除了支氣管壁增厚、肺組織間隙存在炎性細(xì)胞浸潤、肺泡間隔擴(kuò)大外，還可見部分肺泡間隔變薄、斷裂，形成肺大泡（圖2）。

圖2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)變化（HE染色，×100）Figure 2 Pathological changes of lung tissues of rats in each group（HE staining，×100）

2.4 各組大鼠血清IL-8和TNF-ɑ含量

與對照組比較，CSE 組和CSE+LPS 組大鼠血清中IL-8 含量均明顯升高（P＜0.05），CSE 組和CSE+LPS組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組比較，CSE組和CSE+LPS組的TNF-ɑ含量也均明顯升高（P＜0.05），而且CSE+LPS 組TNF-ɑ 含量明顯高于CSE 組（P＜0.05）。各組數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-8和TNF-ɑ含量Table 2 Serum contents of IL-8 and TNF-ɑ in different groups of rats（±s,n=10）

表2 各組大鼠血清中IL-8和TNF-ɑ含量Table 2 Serum contents of IL-8 and TNF-ɑ in different groups of rats（±s,n=10）

注：Control 指正常環(huán)境下飼養(yǎng)的對照組，CSE 指煙草煙霧暴露組，CSE+LPS 指煙草煙霧暴露聯(lián)合細(xì)菌脂多糖氣道內(nèi)滴注組。與Control組比較，★P ＜0.05；與CSE組比，#P ＜0.05。Note：Control，rats in the control group raised in a normal environment；CSE，rats in the cigarette smoke exposure group；CSE+LPS，rats in the intratracheal LPS instillation combined with CSE group. There were 10 rats in each group. ★Represent significant differences compared to the control group，P ＜0.05；#Represent significant differences compared to the CSE group，P ＜0.05.

Group Control CSE CSE+LPS IL-8 ρ/(pg·mL-1)77.48±11.65 162.87±17.95★160.72±33.04★TNF-ɑ ρ/(pg·mL-1)57.43±9.30 109.35±13.78★141.10±18.82★#

3 討論

COPD是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是持續(xù)氣流受限同時(shí)伴有支氣管慢性炎癥增加。目前COPD發(fā)生發(fā)展的確切原因并不明確。吸煙是COPD 高度相關(guān)的危險(xiǎn)因素，煙草中含有多種有害化學(xué)成分和細(xì)小顆粒，能引起肺部炎性反應(yīng)、氣道阻塞和肺泡結(jié)構(gòu)改變［2］。建立符合臨床實(shí)際的COPD 動物模型，是研究COPD發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)，也是深入研究COPD的重要部分。理想的COPD 動物模型應(yīng)具有與人類疾病相一致的臨床特征，滿足以氣流受限為特征的肺功能改變、氣道損傷和肺內(nèi)炎癥細(xì)胞增多等條件［9］。大鼠、小鼠、豚鼠、豬、馬、兔、比格犬等動物均可用于建立COPD 模型。其中，大鼠因基因組序列與人類基因組類似，容易進(jìn)行基因調(diào)控，而且繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低等特點(diǎn)，成為最常用的COPD 模型動物。與小鼠模型相比，大鼠的取材也更加方便。

目前常見的COPD 動物造模方法有多種，如CSE［6，10］、可吸入顆粒物質(zhì)暴露［11-12］、氣管注射LPS［13］等。本研究選擇了CSE 和CSE 聯(lián)合氣管滴注LPS所誘導(dǎo)的COPD大鼠模型，并對這兩種方法建立的模型進(jìn)行比較評價(jià)。

肺功能檢測和肺組織病理檢查是目前公認(rèn)的評價(jià)COPD 動物模型建立是否成功的標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，單純CSE 方法和CSE 聯(lián)合氣管滴注LPS 方法建立的COPD 模型大鼠的肺功能均比對照組明顯下降，肺部炎性細(xì)胞明顯增多，出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和氣道黏液高分泌等慢阻肺癥狀，這與用CSE 聯(lián)合LPS 氣管滴注法建立小鼠COPD 模型和用單純CSE 法建立老年（22周齡）大鼠COPD 模型顯示的肺功能和肺組織病理學(xué)變化［7-8，14］是一致的，表明本研究中兩種方法建立的COPD大鼠模型均成功。

LPS 是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要促炎性糖脂，進(jìn)入肺臟后能刺激單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，合成釋放一系列炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致肺部急性感染，從而形成肺氣腫［15］。在本研究中，CSE 聯(lián)合氣管滴注LPS的方法旨在模擬感染引起COPD 急性發(fā)作從而導(dǎo)致肺功能急劇下降及氣道黏液高分泌的特點(diǎn)。

氣道炎性反應(yīng)在COPD 的發(fā)生及發(fā)展過程中具有重要作用。IL-8 和TNF-ɑ 是重要的促炎因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答中也發(fā)揮作用。促炎因子IL-8在煙草煙霧誘導(dǎo)的肺部炎癥調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用［16］。TNF-ɑ可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞向肺組織趨化、黏附和滲出，釋放彈性蛋白酶，增強(qiáng)氧化反應(yīng)，從而損傷上皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺氣腫［17］。TNF-ɑ 水平能夠反映肺組織的損傷程度，其表達(dá)水平的升高與COPD 患者的氣道炎癥增加和肺功能下降有關(guān)，會增加COPD 的病死率，因此可將其作為評價(jià)肺損傷的可靠指標(biāo)［18］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以CSE 和CSE 聯(lián)合氣管滴注LPS 的方法建立COPD 模型后，大鼠血清中IL-8 和TNF-ɑ 表達(dá)水平均顯著升高，肺功能明顯下降，RI、Cchord、FRC均顯著升高，TV、MV、FEV50/FVC則均顯著降低（P＜0.05）。肺組織病理切片的HE染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)支氣管存在炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁變薄，肺泡腔有不同程度的擴(kuò)張和斷裂；這些結(jié)果均證明這兩種方法建立的COPD 大鼠模型均成功。而且與單純煙霧暴露組相比，CSE 聯(lián)合氣管滴注LPS 組大鼠血清中的IL-8和TNF-ɑ表達(dá)水平升高更為顯著，肺功能下降更加明顯，氣道壁增厚更加顯著，氣道炎癥更明顯，肺泡腔擴(kuò)張、斷裂更為明顯。這表明CSE 聯(lián)合氣管滴注LPS 的方法更能促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致肺組織氣管壁增厚，氣流受限，通氣能力下降。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法都能夠成功建立COPD大鼠模型，而且CSE聯(lián)合氣管滴注LPS方法建立COPD模型后大鼠肺功能損害、肺組織炎癥與人類慢阻肺的臨床病理特點(diǎn)更加接近，提示該方法建立的COPD模型可以更好地模擬慢阻肺的病理變化。

[醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有動物實(shí)驗(yàn)均已通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)（No.202040A）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)法律法規(guī)條例要求進(jìn)行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University (Approval Letter No. 202040A), and all experimental protocols were carried out following the guidelines such asAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal: Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892—2018), ARRIVE 2.0, IGP 2012 and IAVE 2010.

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

盧心鵬負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作、分析數(shù)據(jù)、文章寫作；劉蓉負(fù)責(zé)動物實(shí)驗(yàn)操作、給藥等；黃文博負(fù)責(zé)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析；趙瑾負(fù)責(zé)動物病理分析；李洪濤負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)，文章修改及把關(guān)。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。