新型鈉磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑DZ1462在5/6腎切除高磷血癥模型大鼠中的藥效研究

盧 曉, 張 林, 季 輝, 江善祥

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,南京 210095; 2. 迪哲醫(yī)藥股份有限公司,上海 201203)

大鼠和小鼠最常被用作人類(lèi)疾病模型動(dòng)物，這些動(dòng)物與人類(lèi)基因組同源性很高，易于操作，而且生命周期快，可短時(shí)間內(nèi)得到治療試驗(yàn)效果［1-3］。根據(jù)預(yù)期研究的目的，通過(guò)外科手術(shù)、藥物灌注或環(huán)境改變的操作來(lái)誘導(dǎo)疾病動(dòng)物模型是重要且必要的［4］。5/6腎切除動(dòng)物模型因能夠再現(xiàn)慢性腎病（chronic kidney disease， CKD）患者在臨床中發(fā)生的代謝紊亂和骨病［5-6］，已被用于研究腎臟疾病的發(fā)生機(jī)制、病理生理學(xué)及治療策略等［7-10］。

CKD 患者的代謝廢物（如磷酸鹽等）無(wú)法通過(guò)泌尿系統(tǒng)排出體外，會(huì)累積并形成高磷血癥［11］，繼而出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、軟組織鈣化，以及冠狀動(dòng)脈鈣化等各種癥狀，給高磷血癥患者帶來(lái)巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)壓力。腸道內(nèi)90%以上的磷主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)依靠鈉磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na-phosphate transporter type 2b，NPT2b）。目前臨床上治療CKD 引起的高磷血癥應(yīng)用最廣的是離子交換結(jié)合劑鹽酸司維拉姆（Sevelamer），但是往往服藥量大，容易產(chǎn)生嚴(yán)重的腸胃不良反應(yīng)，并且價(jià)格昂貴，因此該藥物的臨床使用受到一定限制。至今，臨床上尚沒(méi)有通過(guò)抑制腸道內(nèi)NPT2b轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)控制血磷的藥物。

DZ1462作為迪哲醫(yī)藥股份有限公司新研發(fā)的針對(duì)NPT2b 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一種小分子抑制劑，預(yù)期能通過(guò)抑制NPT2b 蛋白的活性降低腸道內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，從而改善高磷血癥。本研究首先采用5/6腎切除聯(lián)合高磷飼料喂養(yǎng)的方法構(gòu)建了大鼠高磷血癥模型，然后在該模型上比較DZ1462 和Sevelamer 的藥物治療效果，以期為國(guó)產(chǎn)新藥DZ1462應(yīng)用于臨床提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK （京） 2021-0006；SCXK （京） 2012-0001］，5～7周齡，雄性；經(jīng)過(guò)檢疫合格后，通過(guò)恒溫運(yùn)輸車(chē)運(yùn)送至上海，進(jìn)入迪哲醫(yī)藥股份有限公司［SYXK（滬）2018-0015］的屏障設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)，適應(yīng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)迪哲醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（IACUC No.1404-RDS-01），所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則及國(guó)內(nèi)外相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理標(biāo)準(zhǔn)要求。

動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境的溫度控制在20～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，相對(duì)外界大氣壓為30 Pa。正常的動(dòng)物飼料為美國(guó)進(jìn)口LabDiet顆粒飼料，動(dòng)物飲用水為反滲透水，飼料容器及飲水瓶經(jīng)高溫高壓滅菌冷卻后使用。

1.2 主要試劑

舒泰50（貨號(hào)為7WLEA）購(gòu)于法國(guó)VIRBAC 公司；DZ1462 化合物（批號(hào)009）為迪哲醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)室合成。特殊定制的高磷飼料（含1.2%磷）購(gòu)自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。Sevelamer（產(chǎn)品批號(hào)B4882B01）購(gòu)自賽諾菲（杭州）制藥有限公司。無(wú)機(jī)磷檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)990-40091）購(gòu)自紹興市創(chuàng)燁生物科技有限公司。

1.3 5/6腎切除法構(gòu)建CKD高磷血癥大鼠模型

選取156 只大鼠，隨機(jī)分為4 組：其中第Ⅰ組6只，設(shè)為正常對(duì)照，飼喂正常飼料且不手術(shù)；第Ⅱ組60只，經(jīng)過(guò)5/6腎切除后飼喂正常飼料；第Ⅲ組60只，經(jīng)過(guò)5/6 腎切除后飼喂高磷飼料；第Ⅳ組30 只，為假手術(shù)組，即只打開(kāi)腹腔，不摘除腎臟，閉合傷口后飼喂高磷飼料。

5/6 腎切除手術(shù)過(guò)程：使用舒泰50（60 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，同時(shí)肌內(nèi)注射痛立定（4 mg/kg）進(jìn)行術(shù)前止痛；背部腎區(qū)剃毛備皮，手術(shù)刀切開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉，將左側(cè)腎臟暴露；縫線結(jié)扎腎臟的上下各1/3并切除，止血棉壓迫止血；觀察確認(rèn)沒(méi)有出血后，將剩余腎臟放回體內(nèi)，閉合傷口，碘酒消毒傷口。1周以后進(jìn)行二次手術(shù)，完整切除右側(cè)腎臟。手術(shù)后飼喂10周以模擬患者腎臟損傷的過(guò)程。

1.4 動(dòng)物模型對(duì)DZ1462 和Sevelamer 的藥效學(xué)研究

1.4.1 給藥方法

與正常對(duì)照Ⅰ組大鼠比較，血清磷水平增加＞50%，是高磷血癥大鼠模型建立成功的判定標(biāo)準(zhǔn)。最終有18只符合條件的高磷血癥模型大鼠（從第Ⅲ組中挑選）入組進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分3組，每組6只。G2（模型對(duì)照）組，不給予任何藥物，飼喂正常飼料；G3組灌胃給予DZ1462 30 mg/kg（給藥體積為10 mL/kg 體質(zhì)量），每天3次，同時(shí)飼喂高磷飼料；G4組灌胃給予碳酸Sevelamer 250 mg/kg（給藥體積為10 mL/kg 體質(zhì)量），每天3 次，同時(shí)飼喂高磷飼料。連續(xù)用藥3周（即21 d）。同時(shí)以第Ⅰ組大鼠繼續(xù)作為正常對(duì)照，命名為G1 組。

1.4.2 臨床觀察

手術(shù)后和用藥后（D0表示給藥前的當(dāng)天）均觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)靈活性、體表被毛、采食量、體質(zhì)量變化等一般情況，以及有無(wú)水腫、腹腔積液或癱瘓等病癥。每天上下午各觀察一次，每次觀察時(shí)長(zhǎng)約30 min。

1.4.3 血清磷含量檢測(cè)每周采集各組大鼠的血清樣本，即尾靜脈采血后，3 000 r/min，離心5 min，取血清后常溫運(yùn)送至上海達(dá)安醫(yī)學(xué)檢測(cè)中心有限公司，使用無(wú)機(jī)磷測(cè)定試劑盒在室溫下利用紫外比色法測(cè)定血清磷含量。血磷抑制率（%）＝（5/6 腎切除手術(shù)后的血清磷含量－藥物治療后的血清磷含量）/（5/6 腎切除手術(shù)后的血清磷含量－正常對(duì)照組的血清磷含量）×100%。

1.4.4 腎臟病理學(xué)觀察

各組動(dòng)物造模10周后經(jīng)二氧化碳安樂(lè)死，解剖獲得腎臟腎盂部分，用體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醛溶液固定后，進(jìn)行病理切片，切片厚度約4 μm。然后使用自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)變化，拍照后用Aperio系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 建模過(guò)程中各組大鼠的臨床表現(xiàn)

第Ⅰ組正常對(duì)照大鼠活動(dòng)靈便，精神狀態(tài)良好，毛色亮澤。第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大鼠精神狀態(tài)較差，有不同程度的毛脫落現(xiàn)象，不喜活動(dòng)，飲食量減少；其中第Ⅲ組（5/6 腎切除手術(shù)+高磷飼料喂養(yǎng)）比第Ⅱ組（5/6腎切除手術(shù)+正常飼料喂養(yǎng)）更嚴(yán)重。在第二次手術(shù)結(jié)束后觀察10周，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大鼠陸續(xù)出現(xiàn)死亡的情況，死亡大鼠存在腹腔積液和不同程度的水腫等現(xiàn)象；其中第Ⅱ組和第Ⅲ組的總體死亡率在第10周時(shí)分別為30%和40%，第Ⅳ組（假手術(shù)+高磷飼料喂養(yǎng)）則只有6%。第Ⅰ組大鼠沒(méi)有出現(xiàn)死亡情況。第1、3、5、7、10周各組大鼠的死亡率見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠在建模10周內(nèi)的死亡率Table 1 Mortality of different group rats within 10 weeks after modeling

2.2 建模過(guò)程中各組大鼠的血清磷含量

與第Ⅰ組（不手術(shù)+正常飼料喂養(yǎng)的正常對(duì)照組）相比，第Ⅳ組（假手術(shù)+高磷飼料喂養(yǎng)）和第Ⅱ組（5/6 腎切除手術(shù)+正常飼料喂養(yǎng)）大鼠隨著飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠的血清磷水平呈逐步下降的趨勢(shì)，而第Ⅲ組（5/6腎切除手術(shù)+高磷飼料喂養(yǎng)）的血清磷水平持續(xù)顯著上升，第8 和第10 周時(shí)與對(duì)照組相比的差異均有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

注：GⅠ，第Ⅰ組正常大鼠飼喂正常飼料；GⅡ，第Ⅱ組5/6腎切除大鼠飼喂正常飼料；GⅢ，第Ⅲ組5/6腎切除大鼠飼喂高磷飼料；GⅣ，第Ⅳ組假手術(shù)大鼠飼喂高磷飼料。★★表示第Ⅰ組和第Ⅲ組在第8周和第10周時(shí)血清磷含量差異有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Note：GⅠ，normal rats with a normal diet（groupⅠ）；GⅡ，5/6 nephrectomy rats with a normal diet（group Ⅱ）；G Ⅲ，5/6 nephrectomy rats with a high Pi diet（group Ⅲ）；G Ⅳ，sham surgery rats with a high Pi diet（group Ⅳ）. ★★Represent serum Pi has a highly significant difference between Group Ⅰand Group Ⅲat the 8th and 10th week（P ＜0.01）.

圖1 不同組別大鼠血清磷測(cè)試結(jié)果

Figure1 Serum phosphorus levels in different groups of rats

2.3 5/6腎切除高磷血癥模型的病理組織學(xué)評(píng)估

HE染色觀察各組大鼠的腎臟組織病理結(jié)果（圖2）顯示，與正常對(duì)照組（GI）大鼠相比，GIII 組（5/6 腎切除手術(shù)+高磷飼料）大鼠的剩余腎臟組織中有明顯的腎小球硬化，腎小管萎縮、退化，間質(zhì)炎癥、纖維化和鈣化等病理現(xiàn)象。其腎損傷情況與CKD 患者類(lèi)似，可以作為CKD動(dòng)物模型。

圖2 5/6腎切除手術(shù)模型大鼠的腎臟組織病理評(píng)估（HE染色）Figure 2 Pathological evaluation of kidney tissue in 5/6 nephrectomy model rats（HE staining）

2.4 不同化合物處理后大鼠血清磷水平的比較

在藥物治療后的第7天、第14天和第21天，和未經(jīng)藥物處理的5/6 腎切除高磷血癥模型對(duì)照組（G2）相比，DZ1462治療組（G3）和Sevelamer治療組（G4）大鼠的血清磷含量均有所降低，并且DZ1462的降磷效果優(yōu)于市售藥物Sevelamer；但DZ1462 給藥組與Sevelamer 給藥組相比，血清磷的絕對(duì)值差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。而在經(jīng)DZ1462 和Sevelamer藥物治療后的第7、14、21 天時(shí)，DZ1462 給藥組大鼠的血清磷抑制率分別為（65±27）%、（61±13）%、（44±16）%，Sevelamer 給藥組大鼠的血清磷抑制率分別為（22±13）%、（47±15）%、（28±11）%，各時(shí)間點(diǎn)兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 用藥后不同組大鼠血清磷水平的比較Figure 3 Comparison of serum phosphorus levels among different groups of rats after drug treatment

3 討論

利用5/6腎切除術(shù)建造動(dòng)物模型已被廣泛用于CKD的藥理藥效學(xué)研究［12-14］，其機(jī)制主要是通過(guò)手術(shù)切除大部分腎臟，導(dǎo)致剩余的腎臟代償性運(yùn)轉(zhuǎn)，腎小球過(guò)度勞作增生，且隨著病情的進(jìn)展，腎實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥斊冢±肀憩F(xiàn)為腎小管萎縮、腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化和局灶性肥大，最終形成CKD。5/6腎切除術(shù)造模后動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲食、體質(zhì)量等方面下降明顯，與人類(lèi)CKD后期的臨床癥狀非常相似［15-19］。本研究所建立的5/6腎切大鼠模型的腎臟病理結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)告一致。

在動(dòng)物品系選擇上，Hamzaoui等［20］比較了2個(gè)品系小鼠129/Sv和C57BL/6JRj中利用5/6腎切術(shù)進(jìn)行心血管和腎臟造模的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)5/6腎切12周后，129/Sv和C57BL/6JRj 雄性小鼠的血漿肌酐水平均顯著升高，但129/Sv 小鼠在多尿、腎臟組織學(xué)損害和蛋白尿增加方面比C57BL/6JRj小鼠表現(xiàn)更明顯，提示5/6腎切對(duì)129/Sv 小鼠心血管和腎臟的影響比C57BL/6JRj 小鼠更明顯。由此可見(jiàn)，不同品系小鼠的造模結(jié)果不同。本研究選擇Wistar 大鼠，是因?yàn)榇笫笫中g(shù)操作比較容易，而且可以從尾靜脈多次重復(fù)采集血樣；相比而言，小鼠眼眶采血的量受限制，且眼眶多次采血不符合動(dòng)物福利要求。

本實(shí)驗(yàn)造模時(shí)第Ⅱ和Ⅲ組大鼠經(jīng)5/6 腎切手術(shù)后，分別飼喂正常飼料和高磷飼料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第Ⅲ組大鼠在造模第8 周和第10 周時(shí)血清磷水平顯著上升，出現(xiàn)典型的CKD癥狀及磷代謝紊亂；與正常對(duì)照組大鼠相比，5/6 腎切+高磷飼料建模大鼠出現(xiàn)了明顯的腎小球硬化，腎小管萎縮、退化，間質(zhì)炎癥、纖維化和鈣化現(xiàn)象，表明高磷飼料有助于5/6腎切模型的構(gòu)建；這與以往文獻(xiàn)報(bào)道［17，21-23］的結(jié)果基本一致，提示本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了大鼠CKD模型，可以應(yīng)用于后續(xù)DZ1462的藥效學(xué)研究。本研究隨后制定了入選藥效研究的高磷血癥模型動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，即與正常大鼠比較，血清磷含量增加大于50%。最終有18只大鼠被選擇繼續(xù)進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)。

DZ1462是本實(shí)驗(yàn)室新合成的針對(duì)NPT2b的特異性小分子抑制劑。目前市面上尚沒(méi)有針對(duì)NPT2b 靶點(diǎn)的藥物。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯緿Z1462能否通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)血清磷水平，緩解CKD患者的鈣磷代謝異常，改善腎功能，減輕臨床癥狀。本研究利用5/6腎切高磷血癥大鼠模型，對(duì)DZ1462 及臨床上應(yīng)用的陰離子樹(shù)脂結(jié)合劑Sevelamer 的藥效進(jìn)行比較。結(jié)果表明，DZ1462（30 mg/kg）和Sevelamer（250 mg/kg）每天3 次口服給藥21 d的治療后大鼠血清磷含量均有所減少，且DZ1462的降磷效果優(yōu)于Sevelamer，但兩者的絕對(duì)值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，兩者的血清磷抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

目前全球范圍內(nèi)在研的針對(duì)NPT2b 的小分子抑制劑有日本Astella 公司的ASP3325 和Daiichi Sankyo 公司的DS2330b。兩家公司公布的Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，ASP3325 和DS2330b 均不能改善CKD 患者的高血磷狀態(tài)［24-25］，這與本研究結(jié)論有差異。根據(jù)已公布的數(shù)據(jù)推測(cè)，ASP3325 和DS2330b 這兩個(gè)化合物治療失敗的原因可能是其作用靶點(diǎn)的特異性不夠，同時(shí)藥物暴露時(shí)間不足，兩個(gè)化合物的體內(nèi)暴露量也遠(yuǎn)超DZ1462，同時(shí)不同物種間磷的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制也可能有所不同，這些都是需要重點(diǎn)考慮的因素。總之，口服特異性小分子NPT2b 抑制劑治療高磷血癥的作用仍然難以確定，值得繼續(xù)研究。

需要說(shuō)明，本研究尚存在一定的局限性，包括沒(méi)有測(cè)試更多的指標(biāo)，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23），以及未進(jìn)行心臟肥大、主動(dòng)脈鈣化、次生海綿體區(qū)的海綿骨分析等，未能判斷DZ1462對(duì)大鼠心臟、組織鈣化和骨質(zhì)疏松等方面的影響。本課題組今后將在動(dòng)物模型上檢測(cè)更多的腎臟相關(guān)指標(biāo)，并通過(guò)建立更有效的人源化動(dòng)物模型來(lái)研究DZ1462對(duì)高磷血癥的治療效果。

綜上所述，本研究利用大鼠5/6腎切手術(shù)聯(lián)合飼喂高磷飼料的方式成功建立了高磷血癥模型。使用該模型對(duì)DZ1462的藥效學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)與臨床上應(yīng)用廣泛的Sevelamer進(jìn)行了藥效比較；結(jié)果表明，DZ1462對(duì)大鼠血清磷的抑制率顯著高于Sevelamer，表明在大鼠5/6 腎切模型上，DZ1462 具有良好的降磷效果。本研究結(jié)果提示，DZ1462 作為一種全新的NPT2b 抑制劑，能夠部分阻斷腸道磷離子的吸收，有著與Sevelamer 完全不同的作用機(jī)制，有望成為高血磷癥患者的另外一個(gè)用藥選擇。

[醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)迪哲醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（IACUC No.1404-RDS-01）。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)法律法規(guī)條例要求進(jìn)行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Ethics Committee of Dizhe Pharmaceutical Co., Ltd. (IACUC No. 1404-RDS-01), and all experimental protocols were carried out following the guidelines such asAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892—2018),ARRIVE 2.0,IGP 2012 and IAVE 2010.

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

盧曉參與并負(fù)責(zé)DZ1462 化合物的前臨床研發(fā)項(xiàng)目中體內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)，并撰寫(xiě)論文；張林參與DZ1462 化合物體內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)及論文修改；季輝負(fù)責(zé)文章內(nèi)容的校對(duì)和審核；江善祥指導(dǎo)整個(gè)實(shí)驗(yàn)研究及論文審核。

[利益聲明]Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。