不同軟糖基質中甲鈷胺含量的檢測

余 斐，李偉佳，張敬鍇，林岱濱，李欣純

（廣東億超生物科技有限公司，廣東汕頭 515000）

維生素B12又稱鈷胺素，是唯一的一種需要腸道內分泌物（內因子）幫助才能吸收的維生素，其家族成員主要包括氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲鈷胺[1]。甲鈷胺作為維生素B12在體內的活性形式之一，其對外神經組織具有良好的傳遞性，可促進核酸-蛋白-脂肪的代謝，可修復損傷的神經組織[2]。維生素B12是人體必需且不能自身合成的重要營養物質，可從食物中獲取。貧血和脊髓亞急性聯合變性是維生素B12缺乏引起的典型表現，維生素B12缺乏也可引起不自主運動、視力下降、癲癇、認知情感障礙、自主神經功能障礙及皮膚色素沉著等不典型表現[3]。

甲鈷胺作為維生素B12來源添加到軟糖膳食補充劑中的研究較少。軟糖目前主流的基質有明膠和果膠兩種，現采用HPLC法測定不同軟糖基質中甲鈷胺含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀；甲鈷胺對照品（93.9%），中國食品藥品檢定研究院，批號100692-202006；磷酸二氫鉀（色譜純），科密歐，含量≥99.50%；氫氧化鈉（分析純），光華科技，含量≥85.0%；磷酸（色譜純），美國天地，含量≥85.0%；乙腈（色譜純），美國天地，含量≥99.90%。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：月 旭UItimate AQ-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液 （用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液或磷酸調節pH值至4.5）-乙腈（84∶16）；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL；檢測波長：342 nm；進樣量：10 μL。

1.3 供試品溶液的制備

稱取5.0 g供試品于50 mL具塞塑料離心管中，60 ℃水浴溶解，回室溫后加水定容至50 mL， 10000 r/min離心2 min。上清液經0.45 μm濾膜過濾，收集濾液，即為供試品溶液。

1.4 標準曲線的制備

準確稱取100 mg甲鈷胺標準品加水溶解定容，配制成濃度為2.0 mg/mL的甲鈷胺標準儲備溶液，棕色瓶保存。分別吸取一定體積的甲鈷胺標準儲備溶液，加水稀釋，制備一系列標準溶液，標準工作曲線溶液濃度為4 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、 80 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，按上述色譜條件采用高效液相色譜儀分析，以濃度為橫坐標，以測得峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.5 測定方法

將供試品溶液按上述色譜條件進高效液相色譜儀測定，采用外標法通過上述標準曲線計算其濃度。

2 結果與分析

2.1 方法專屬性的考察

取甲鈷胺陰性樣品，依上述方法制備處理、檢測，測定圖譜如圖1、圖2所示。由圖可知，不存在基質干擾情況，色譜條件可行。

圖1 對照品色譜圖

圖2 甲鈷胺陰性樣品色譜圖

2.2 溶液穩定性考察

將濃度為40 μg/mL的甲鈷胺對照溶液按1.2色譜條件進行0 h、4 h、6 h和10 h溶液穩定性考察，通過峰面積的變化考察溶液穩定性。結果顯示，4 h、6 h、10 h的溶液對0 h溶液的偏差分別為1.2%、0.3%、0.3%，符合溶液穩定性≤5%的要求。說明甲鈷胺對照溶液在10 h內是穩定的，見表1。

表1 溶液穩定性考察結果

2.3 線性范圍與檢測限、定量限的測定

依1.4測定數據，擬合獲得回歸方程為y= 0.8907x-2.3952，R2=0.9997，表示在4～200 μg/mL濃度范圍內，有良好線性。分別取甲鈷胺明膠基質陰性樣品和果膠基質陰性樣品，加標，MDL方式測定，結果顯示在供試品稱樣量為5 g，稀釋倍數為50 mL時，測得甲鈷胺在軟糖明膠基質中檢出限0.53 mg/kg，定量限1.77 mg/kg；甲鈷胺在軟糖果膠基質中檢出限0.22 mg/kg，定量限0.74 mg/kg。

2.4 精密度和準確度的測定

取甲鈷胺明膠基質陰性樣品，分別加入一定量的甲鈷胺標準品溶液，按1.3步驟操作，使之成為理論濃度分別約為5 μg/mL、45 μg/mL、110 μg/mL的樣品，每個濃度平行操作6份，按照1.2的色譜條件上機測定，計算各組樣品含量的RSD，結果如表2所示。試驗結果顯示，明膠基質陰性樣品3個濃度水平的準確度分別為3.4%、2.6%、1.7%，回收率分別為93.51%～106.50%，均達到可接受標準。

表2 測定甲鈷胺明膠基質陰性樣品精密度和準確度

取甲鈷胺果膠基質陰性樣品分別加入一定量的甲鈷胺標準品溶液，按1.3步驟操作，使之成為理論濃度分別加入濃度為7 μg/mL、48 μg/mL和 120 μg/mL的樣品，每個濃度平行操作6份，按照1.2的色譜條件上機測定，計算各組樣品含量的RSD，結果如表3所示。試驗結果顯示，果膠基質陰性樣品3個濃度水平的準確度分別為1.2%、1.1%、0.8%，回收率101%～105%，均達到可接受標準。

表3 測定甲鈷胺果膠基質陰性樣品精密度和準確度

2.5 光照對軟糖中甲鈷胺含量的影響

根據相關文獻的研究，甲鈷胺對光不穩定[4-5]。因此，將標示含量為500 μg/2.5 g的甲鈷在普通日光燈條件下，光照1 h、2 h、3 h，考察光照對軟糖中甲鈷胺含量的影響，甲鈷胺降解率見表4。由表中數據可知，添加了甲鈷胺的軟糖，光照3 h后，降解率高達70.4%。

表4 甲鈷胺軟糖光照實驗降解率統計

3 結論

精密度測定結果顯示，甲鈷胺明膠基質陰性樣品3個濃度RSD在1.7%～3.4%，甲鈷胺果膠基質陰性樣品3個濃度RSD在0.8%～1.2%，能滿足精密度≤5%的要求。準確度測定結果顯示，甲鈷胺明膠基質陰性樣品3個濃度回收率在93.51%～106.50%，甲鈷胺果膠基質陰性樣品3個濃度回收率在101%～105%，能滿足回收率80%～110%的要求。光照實驗結果提示，針對添加了甲鈷胺的軟糖，需要選擇具有遮光材質的包材，避免光照對甲鈷胺含量的影響。