HPLC檢測糕點中阿斯巴甜含量的不確定度評定

唐璐子，張 洋

（安徽國科檢測科技有限公司，安徽合肥 230041）

近年來，隨著人們對食品中含糖量的關(guān)注，諸多甜味劑頻繁出現(xiàn)在大眾的視野中。甜度高、熱量低的特點使這些甜味劑被用來代替膳食中的糖。其中人工合成的阿斯巴甜一直遭受質(zhì)疑，因為阿斯巴甜在應(yīng)用中存在諸多隱患，如致癌、誘發(fā)腦瘤等，苯丙酮尿癥患者應(yīng)避免使用，過量使用可能會影響人們的生命安全。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中規(guī)定，糕點中天門冬酰苯丙氨酸甲酯（又名阿斯巴甜）所允許最大使用量為1.7 g/kg[1]。

在檢測工作中，檢測結(jié)論的準確性和質(zhì)量也被提出了更高的要求，對檢驗結(jié)論的不確定度評定工作倍受重視。食品中測定不確定度的常用方法是A類、B類評定法。A類是對重復(fù)性測量的實驗數(shù)據(jù)進行分析計算，B類評定不同于A類評定的方法，是分析實驗過程中存在的導(dǎo)致結(jié)果不準確的因素，對每個因素造成的誤差進行分析計算。

目前，針對食品中阿斯巴甜的檢測的有關(guān)研究中，雖沒有詳細資料表明糕點中阿斯巴甜測定的不確定度評定過程，但在全國各地監(jiān)督抽查和第三方檢測公司委托檢驗過程中，發(fā)現(xiàn)在糕點中對阿斯巴甜的應(yīng)用較多[2-4]。本文基于《測量不確定度的要求》（CNAS—CL 01—G 003：2019）[5]、《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL 006：2019）[6]、《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[7]、《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[8]和《食品安全國家標準 食品中阿斯巴甜和阿力甜的測定》（GB 5009.263—2016）[9]中的技術(shù)規(guī)范，對阿斯巴甜在糕點中含量的不確定度進行分析計算，找到影響檢測結(jié)果的主要原因，為實驗的質(zhì)量控制和檢測結(jié)論的準確度，提出了科學(xué)、可信的 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；去離子水（實驗室自制符合GB/T 6682—2008規(guī)定）；阿斯巴甜標準品（純度99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；糕點來自市場抽查隨機樣本。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀（Agilent）；ATX224電子天平（島津）；AUW120D電子天平（島津）。

1.3 實驗方法

參照《食品安全國家標準 食品中阿斯巴甜和阿力甜的測定》（GB 5009.263—2016）中焙烤食品的方法處理試樣，配制標準溶液曲線。

數(shù)學(xué)模型如下式：

式中：C0為樣品中阿斯巴甜的濃度，g/kg；A0為試樣溶液的色譜峰高與保留時間的積分值（即峰面積）；A1為標準溶液的色譜峰高與保留時間的積分值（即峰面積）；C1為標準溶液的濃度，g/kg；m為試樣質(zhì)量，g；V為樣品最后定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來源分析

在隨機或系統(tǒng)影響下引入不確定度分量，就可以判斷出由試樣稱量、標準溶液配制、定容和擬和標準曲線等所帶入的不確定度[10-13]。如圖1所示。

圖1 不確定度來源圖

2.2 標準溶液的不確定度評定

2.2.1 標準品純度引入的不確定度

標準品的證書給出純度及不確定度，但是在檢驗中有可能同時用到多個標準物質(zhì)繪制工作曲線，則需要計算多個標準物質(zhì)的相對標準不確定度的均方根。例如，由阿斯巴甜標準樣品說明書可知其純度大于98%，其區(qū)間的半寬度即純度（99±1）%。屬于B類不確定度，采用均勻分布，可以算出對標準品純度所引入的標準不確定度和相對標準不確定為。

2.2.2 標準品稱量引入的不確定度

標準品稱量所用的天平感量為十萬分之一，按照檢定規(guī)程中給出的最大允許誤差計算得，a=0.0005 g，根據(jù)均勻分布，不確定度為，由于標準品實際稱取為0.10025 g，因此相對不確定度為u2rel=0.00029/0.10025 =2.9 ×10-3。

2.2.3 標準儲備液配制引入的不確定度

玻璃器皿的不確定度主要來源是玻璃器皿的示值偏差和玻璃器皿受環(huán)境溫度改變導(dǎo)致收縮或膨脹引起溶液體積變化。

玻璃器皿的示值偏差按照國家計量技術(shù)規(guī)范 JJG 196—2006中給出的最大允許差d以及均勻分布進行計算，不確定度為。

玻璃器皿出廠時已在20 ℃恒溫下校正。計算其在室溫下對溶液體積改變的不確定度，重點是要判斷其在溶液配制和使用時的室溫下是否有變化。如果配制和使用溶液時是在相同室溫下，則不需要再考慮液體體積改變的影響。本實驗中操作溫度為17～23 ℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，在95%置信區(qū)間下，k=1.96，玻璃器皿體積變化的標準不確定度為。合成標準不確定度為，相對標準不確定度為。如果在實際測量中溫度波動較小或溶劑膨脹系數(shù)較小，該項產(chǎn)生的影響相對較小可忽略。

配制阿斯巴甜標準儲備液所用的是100 mL 的A級容量瓶，根據(jù)上述內(nèi)容可以測算出阿斯巴甜標準儲備液的相對不確定度為= 0.000588。

2.2.4 配制標準工作溶液過程中玻璃量器產(chǎn)生的不確定度

配制標準工作溶液過程中使用了一系列玻璃量器，需要注意的是這里使用不同的25 mL移液管。評定方法同2.2.3，結(jié)果見表1。

由表1中數(shù)據(jù)可知，配制標準工作溶液過程中玻璃量器產(chǎn)生的相對不確定度為u2rel(V)=0.0051。

表1 移液管和容量瓶的不確定度

2.2.5 標準溶液的不確定度分量的合成

合成2.2.1～2.2.4步驟標準溶液的配制過程中的不確定度分量，則標準溶液的相對標準不確定度=0.00778。

2.3 樣品制備過程引入的不確定度

2.3.1 樣品稱量過程的不確定度

樣品稱量過程的不確定度主要來源于稱量過程的變動性以及天平的準確性。天平的準確性由天平分辨力的不確定度以及天平線性的不確定度合成。檢定證書提供天平線性為0.15 mg，并假設(shè)其均勻分布，其標準不確定度u3=0.15/=0.087 mg，天平的分辨率為0.1 mg，區(qū)間半寬度a=0.1/2=0.05，則u4=0.05/=0.029 mg；稱量過程的變動性也可通過多次稱量獲得，因此稱量時產(chǎn)生的標準不確定度為，稱樣量為10.0785 g，所以相對標準不確定度。

2.3.2 樣品定容過程引入的不確定度

定容過程使用的容量瓶是容量為50 mL的A級容量瓶，按照標準規(guī)定，其最大允許誤差d為±0.05 mL，按照2.2.3計算后，在此過程帶入的相對標準不確定度為u3rel(V)=0.000661。

2.4 標準曲線擬合過程不確定度

用標準儲備液配制500.0 μg/mL、250.0 μg/mL、125.0 μg/mL、50.0 μg/mL和25.0 μg/mL的5種濃度標準工作溶液，用高效液相色譜儀測定，每一濃度測定3次，數(shù)據(jù)見表2。橫軸是濃度C，縱軸是峰面積S，擬合標準曲線數(shù)學(xué)模型為S=aC+b，計算線性方程的斜率為S=2279×C+6817（a=2279，b=6817），相關(guān)系數(shù)為R=0.9999。

表2 系列標準工作溶液峰面積測定結(jié)果

按（2）式（貝塞爾公式）計算S殘差的標準偏差，按（3）式計算阿斯巴甜待測液的標準不確定度。

式中：C0為根據(jù)線性方程計算的待測液的質(zhì)量濃度，C0=161 μg/mL；p=6，為C0的測量次數(shù)；Si為各測量結(jié)果值；Sj為線性方程計算值，Sj= 2279×Cj+6817；n為測定標準溶液的測量次數(shù)，n=15；Ci為標準溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL。

根據(jù)表2數(shù)據(jù)可以計算得u(C0)=0.393，曲線擬合的過程帶入相對標準不確定度u6rel=0.00246。

2.5 重復(fù)性試驗過程中引入的不確定度

根據(jù)1.3進行前處理的樣品，對糕點中的阿斯巴甜重復(fù)進行了6次獨立實驗，檢驗結(jié)果分別為 0.802 g/kg、0.794 g/kg、0.832 g/kg、0.810 g/kg、 0.798 g/kg和0.803g/kg。根據(jù)貝塞爾公式（1）計算重復(fù)性引起的不確定度u(c—)，計算公式如下：

式中：c為6次重復(fù)測試值的平均值；n為測定次數(shù)，n=6；c為待測液中阿斯巴甜的濃度，g/kg。

2.6 總合成相對標準不確定度的確定

總合成相對標準不確定度為u0rel== 0.0207。

2.7 擴展標準不確定度

置信水平p=95%，包含因子k=2，則合成標準不確定度= 0.0207 × 0.806 = 0.0167。

相對擴展不確定度U=K×uc=0.033。

2.8 測量不確定度報告

用GB 5009.263—2016方法重復(fù)6次測定糕點中阿斯巴甜平均含量為（0.806±0.033）g/kg，k=2。

3 結(jié)論

本文主要從配制標準儲備溶液、配制標準工作溶液、擬合標準曲線、試樣稱量、試樣定容、重復(fù)性測試6個方面對糕點中阿斯巴甜測定過程中的不確定度進行分析，根據(jù)GB 5009.263—2016檢測糕點中阿斯巴甜時，應(yīng)注意，測量重復(fù)性、試樣稱量和定容過程、標準溶液的配制過程和標準曲線的擬合，從而計算不確定度以確保檢測結(jié)論的準確性。