不同前處理方法對魚肉中氯霉素殘留檢測研究

馮 惠，唐一秋

（昆明市食品藥品檢驗研究院，云南昆明 650000）

氯霉素，化學式為C11H12Cl2N2O5，是一種從委內瑞拉鏈霉菌中分離出來的廣譜抗菌素，易溶于甲醇、乙醇、丙醇和乙酸乙酯，其化學結構含有對硝基苯基、丙二醇和二氯乙酞胺基3個部分[1-3]。氯霉素對許多需氧革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌、立克次氏體、衣原體及菌質體都有抑制作用，尤其對沙門氏菌屬、流感桿菌屬等有很好的抗菌能力，因此被人們過量使用，導致水產食品及其生活環境中殘留有大量的氯霉素[4-6]。食用氯霉素藥物殘留含量過多的食物會損害人體肝臟以及抑制骨髓的造血功能，呈現出具有可逆性的骨髓抑制作用，如貧血、再生功能障礙性貧血，此外還可能導致鼻出血、高熱、咽痛、黃疸、腹脹、腹瀉、食欲減退以及惡心、嘔吐等病癥[7-9]。在水產養殖中過度使用氯霉素，不僅會降低魚類的免疫力，還會使病原菌有不同程度的抗藥性[10]。魚類在攝入大量氯霉素后，隨著血液循環，機體會將其分布到肺、骨等組織器官，削弱其免疫能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 mL Captiva EMR-Lipid小柱（安捷倫）、有機濾膜、注射器、分液漏斗、棕色心形瓶、乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純）、正丙醇（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、丙酮（分析純）和氯霉素標準品（100 μg/mL）。

1.2 儀器與設備

液相色譜-串聯質譜-質譜儀（AB Triple Quad? 3500）、旋轉蒸發儀（步琦ROTAVAPOR R210）、氮吹儀（睿科Auto EVA）、離心機（貝克曼ALLEGRA X-30R）、天平、均質機和超純水器。

1.3 色譜條件

色 譜 柱：CAPCELL PAK ADME-HR（2.1 mm× 100 mm，2 μm，）；流動相：流動相A（5 mmol/L乙酸銨），流動相B（乙腈）。

1.4 質譜條件

離子化模式：負離子技術模式（ESI-）；質譜掃描方式：多反應進行監測（MRM）；氣簾氣（CUR）：35 psi；離子化電壓（IS）：-4500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；GS1：50 psi；GS2：50 psi；進樣量：3 μL；色譜柱流速：0.3000 mL/min，質譜。

1.5 樣品的制備、提取

將所購昆明市市售淡水魚（新鮮魚肉）制成碎塊，放入冰柜冷凍保存。

1.5.1 實驗室優化方法

稱樣5 g，10 mL乙酸乙酯提取，渦旋振蕩5 min，離心10 min，合并上清液，10 mL乙酸乙酯提取殘渣，渦旋振蕩，離心10 mL，合并上清液，40 ℃旋蒸，6 mL乙腈溶解殘渣，加入6 mL乙腈飽和的正己烷振蕩，靜置，棄上層正己烷，40 ℃旋蒸，5 mL 80%乙腈水溶液溶解殘渣，過Lipid除脂小柱，收集濾液，過有機濾膜（0.22 μm），裝瓶，待測。

1.5.2 GB/T 22338—2008方法

稱樣5 g，加入100 μL氯霉素內標液0.2 mL，加入30 mL乙腈，勻漿，離心5 min，收集上清液，加入15 mL乙腈飽和的正己烷，振蕩5 min靜置分層，乙腈層轉移至100 mL棕色雞心瓶溶解殘渣，振搖 3 min，離心5 min。收集上清液，振蕩5 min靜置分層。乙腈層加5 mL正丙醇，40 ℃旋蒸，5 mL丙酮-正己烷（1+9）溶解殘渣，5 mL丙酮-正己烷（1+9）淋洗LC-Si硅膠小柱，殘渣溶解液轉移至小柱，丙酮-正己烷（6+4）5 mL洗脫收集于雞心瓶，40 ℃旋蒸， 5 mL水定容，過有機濾膜（0.45 μm）裝瓶，待測。

2 結果與分析

2.1 標準溶液的配制

分 別 取 氯 霉 素 標 液（100 ng/mL）0.005 mL、 0.010 mL、0.050 mL、0.100 mL、0.200 mL、0.400 mL、 0.800 mL和1.000 mL，80%乙腈水定容至10 mL，氯霉素標液的濃度為0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、 0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、4.00 ng/mL、 8.00 ng/mL和10.00 ng/mL。各個濃度進樣3次，按照選定的色譜條件測定，橫坐標以各標液的濃度表示，縱坐標以各組分的峰面積表示，以峰面積對濃度做線性回歸方程，繪制出各組分的標準工作曲線。氯霉素標準曲線校準曲線公式：f(x)=2513.97864x+ 48.73404，R=0.99922。

2.2 方法的精密度、準確度實驗

稱取樣品5.0 g，分別向樣品中加入100 ng/mL的混合標準儲備液5 μL、10 μL、50 μL，GB/T 22338—2008方法在加入標準溶液的基礎上分別都加入 100 μg/mL氯霉素內標溶液0.02 mL處理樣品，采用液相色譜-串聯質譜（Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）檢測。每個添加濃度分別平行測6次。氯霉素的回收率以各組樣品間的測定濃度和加入量的不同來計算，結果見表1。GB/T 22338—2008方法的平均加標回收率在97.9%～105.0%；實驗室優化方法的平均加標回收率在90.1%～98.4%。

表1 氯霉素回收率

2.3 基質效應實驗

稱取魚肉樣品5.0 g，向稱取的樣品中加入100 ng/mL的混合標準儲備液5 μL、10 μL、50 μL，提取處理，采用LC-MS/MS檢測，每個添加濃度平行測定3次，氯霉素的回收率以各組樣品間的測定濃度和加入量的不同來計算，結果見表2。

表2 氯霉素回收率（不加基質標液）

2.4 檢出限與定量限的測定

選取標樣（1 ng/mL）連續測定10次，確定其基線噪音值（S/N），計算平均值。按照3倍信噪比來計算其檢出限。定量限可用10倍信噪比來計算可得。實驗室優化法氯霉素的檢出限為0.008 μg/kg，定量限為0.027 μg/kg。國家標準方法氯霉素的檢出限為0.015 μg/kg，定量限為0.049 μg/kg。實驗室法氯霉素的檢出限小于GB/T 22338—2008的檢出限，表明此方法靈敏度較高。

3 結論與討論

通過以上實驗過程及實驗數據對比，GB/T 22338—2008方法與實驗室優化方法二者各自的優缺點見表3。實驗室優化后的方法在處理時間、試劑用量、實驗步驟和器皿使用上皆少于GB/T 22338—2008方法，且凈化效果和靈敏度都優于GB/T 22338—2008方法，從而達到更快速、簡捷和經濟的目的。

表3 兩種方法比較