基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討附子甘草配伍治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制*

王利勤 熊鳴峰 王騰宇 萬海同 熊墨年 吳春紅

（1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江西南昌 330006；2南昌大學(xué)中醫(yī)十層脈研究所 江西南昌 330006；3浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053；4江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046）

附 子（Aconitum carmichaeliDebx.）與 甘 草（Glycyrrhiza uralensisFisch）都是傳統(tǒng)常用中藥。附子首次出現(xiàn)在《神農(nóng)本草經(jīng)》的下品中，大毒，性熱，歸心、脾、腎經(jīng)，味辛甘，主要有回陽救逆、補(bǔ)火助陽等功效，為“回陽救逆第一品藥”；甘草，俗稱“國老”，性平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，味甘，主要有益氣健脾、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效[1]。古今醫(yī)者，一直有從事附子及其相關(guān)配伍的研究，如《醫(yī)理真?zhèn)鳌分兄赋觯骸案阶哟笮链鬅幔銐严忍煸枴薄胺歉阶硬荒芡煊^之真陽”“能補(bǔ)坎中真陽，真陽為君火之種，補(bǔ)真火即是壯君火也”[2]。陶弘景《神農(nóng)本草經(jīng)集注》記載道：“俗方每用附子，皆須甘草、人參、生姜相配者，正制其毒故也。”可見附子雖藥效峻猛，但是毒性也較大，臨床上使用時(shí)需同時(shí)兼顧其毒性。我們也發(fā)現(xiàn)，醫(yī)者常用藥性緩和的甘草配伍附子，用甘草之緩性來減附子之毒及緩其烈性，比如經(jīng)典方劑四逆湯等。而《傷寒雜病論》《金匱要略》中關(guān)于附子的臨床應(yīng)用大約有60條條文，其中炙甘草與生甘草均可與附子配伍，根據(jù)需要選擇不同炮制方式的甘草，中醫(yī)四大經(jīng)典中有關(guān)附子甘草配伍的條文奠定了后代附子配伍甘草作為經(jīng)典藥對(duì)的基礎(chǔ)，并且一直被歷代中醫(yī)學(xué)者較好地應(yīng)用于臨床[3]。我們知道，慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure, CHF）是大部分常見心血管疾病的最終病理結(jié)局，也是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的最常見死因之一。在前期研究中，我們課題組發(fā)現(xiàn)附子甘草藥對(duì)對(duì)于CHF具有顯著的保護(hù)作用，但是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)附子甘草配伍對(duì)CHF治療作用的研究尚未見。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network Pharmacology）[4]是指通過生物信息學(xué)、高通量組學(xué)及計(jì)算生物學(xué)等多學(xué)科融合，根據(jù)中藥所具有的多組分、多靶點(diǎn)、機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度闡述中藥、配伍以及方藥的藥理作用、治療作用靶點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制的技術(shù)[5]。本研究將借助網(wǎng)絡(luò)模塊及基因本體論（Gene Ontology Biology Process, GO）的分析方法，較系統(tǒng)地闡述附子甘草配伍藥對(duì)治療CHF的機(jī)制。由于生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)相互間密切合作，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction, PPI）是許多生物過程的重要環(huán)節(jié)，而GO是目前認(rèn)為對(duì)PPI的解釋較有力的方法之一[6]。本研究將應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)附子甘草這一經(jīng)典配伍藥對(duì)對(duì)CHF的治療作用進(jìn)行探析，分析其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 附子、甘草主要活性成分及成分靶點(diǎn)的收集為了收集“附子”與“甘草”的化學(xué)成分及成分靶點(diǎn)，我們選取中醫(yī)藥系統(tǒng)內(nèi)比較全面的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索。其中TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwsuaf.edu.cn）是一個(gè)常用的用于分析中藥成分藥理學(xué)的中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫，主要可用于查詢常見中藥的化學(xué)成分[7]。我們?cè)赥CMSP數(shù)據(jù)庫輸入“附子”“甘草”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，再根據(jù)該數(shù)據(jù)庫的相關(guān)搜索結(jié)果，結(jié)合其他參考文獻(xiàn)的研究方法[8]，并將口服利用度（Oral Bioavailability, OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness, DL）≥0.18作為篩選條件，最后篩選得到附子有效中藥成分為21個(gè)，甘草有效中藥成分為92個(gè)。為提高我們檢索結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們同時(shí)選用TCM數(shù)據(jù)庫（http://tcm.cmu.edu.tw/）[9]，也輸入“附子”“甘草”作為關(guān)鍵詞進(jìn)一步檢索。通過將上面2個(gè)數(shù)據(jù)庫中所收集的化學(xué)成分進(jìn)行整理，再輸入STITCH數(shù)據(jù)庫（https://www.stitchdata.com/），一個(gè)用于檢測已知的以及被預(yù)測的化合物和蛋白質(zhì)之間相互關(guān)系的平臺(tái)，對(duì)“附子”與“甘草”化學(xué)成分的成分靶點(diǎn)進(jìn)行歸集。

1.2 CHF的疾病靶點(diǎn)收集為了收集CHF的疾病靶點(diǎn)，我們選取用于研究人類遺傳病以及基因的知識(shí)庫OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）數(shù)據(jù)庫（http://www.Omim.org）[10]以及Gene Card（http://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫。分別在這2個(gè)數(shù)據(jù)庫內(nèi)以“Chronic Heart Failure”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集與CHF相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，去除重復(fù)數(shù)據(jù)后再整理所有靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建根據(jù)收集的“附子”與“甘草”化學(xué)成分及成分靶點(diǎn)、慢性心力衰竭疾病靶點(diǎn)，再參考相關(guān)文獻(xiàn)中的研究方法[11]，應(yīng)用生物信息分析軟件Cytoscape 3.6.1分別構(gòu)建“附子”與“甘草”的成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、成分靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，以及CHF的疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并構(gòu)建上述藥物成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)。在構(gòu)建“附子”與“甘草”成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)時(shí)，將“1.1”整理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件即可得成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。在構(gòu)建“附子”與“甘草”成分靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)和CHF疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)時(shí)，我們使用用于基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的可視化分析Bisogenet插件，將方法設(shè)置為“Input nodes and its neighbors”，參數(shù)為1，輸出方式定為基因。將構(gòu)建疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的方法設(shè)置為“Input nodes only”，通過軟件獲取“附子”“甘草”的成分靶點(diǎn)與CHF的疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；再應(yīng)用Bisogenet插件中的Merge功能，取得以上所獲網(wǎng)絡(luò)圖的交集部分為“附子”配伍“甘草”治療CHF的作用靶點(diǎn)候選點(diǎn)。

1.4 通路整合與分析將“1.3”所取的候選點(diǎn)制作韋恩圖并進(jìn)行相關(guān)分析，了解CHF的靶點(diǎn)和“附子”與“甘草”潛在靶點(diǎn)的交集，共篩選獲得154個(gè)交點(diǎn)。再將所獲的靶點(diǎn)交集點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，同時(shí)利用基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）進(jìn)行相關(guān)通路注釋分析，并根據(jù)富集結(jié)果，獲得有關(guān)條形圖。相關(guān)通路的蛋白質(zhì)相互作用信息可從具有檢索可能靶點(diǎn)預(yù)期作用的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫STRING 9.1（http://string-db.org）中獲取[12]，篩選條件是OB≥30%，DL≥0.18。該數(shù)據(jù)庫獲取的數(shù)據(jù)可信度高，具有實(shí)時(shí)更新的功能，同時(shí)可進(jìn)行信度評(píng)分。為了進(jìn)一步分析藥物及疾病之間的作用靶點(diǎn)，我們選擇Cytoscape 3.6.1軟件中的分析聚類系數(shù)、度分布及連接組件等參數(shù)[13]，基于拓?fù)鋮?shù)，與隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)相比，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)無標(biāo)度、小范圍和模塊化等特性分析。拓?fù)鋮?shù)信息是分析可視化合成組織與結(jié)構(gòu)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的有效信息[14]。經(jīng)過以上拓?fù)鋮?shù)信息分析，我們進(jìn)一步對(duì)PPI進(jìn)行模塊劃分，為了獲取更精確的靶點(diǎn)信息，我們?cè)O(shè)置網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)連接度的臨界值為大于3。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)成分、疾病靶點(diǎn)的收集TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)附子17個(gè)，甘草92個(gè)；TCM數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)附子19個(gè)，甘草92個(gè)。利用STITCH數(shù)據(jù)庫對(duì)TCMSP及TCM數(shù)據(jù)庫收集所得的化合物進(jìn)行成分靶點(diǎn)收集，發(fā)現(xiàn)有靶點(diǎn)的化合物共為81個(gè)，其中相對(duì)應(yīng)的成分靶點(diǎn)為169個(gè)。以“Chronic Heart Failure”為關(guān)鍵詞在OMIM、Genecard這2個(gè)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲得相關(guān)疾病的靶點(diǎn)共8 668個(gè)。疾病的靶點(diǎn)和藥物潛在靶點(diǎn)的交集有154個(gè)。見圖1。

圖1 疾病的靶點(diǎn)和藥物潛在靶點(diǎn)的韋恩圖

2.2 成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)在該網(wǎng)絡(luò)中，外圈分子紅色（除標(biāo)注#及▲外）是來源甘草的，藍(lán)色（標(biāo)注#）是附子的，黃色（標(biāo)注▲）的是兩者共有的。內(nèi)部的靶點(diǎn)紅色（除標(biāo)注*外）是甘草的作用靶點(diǎn)，黃色（標(biāo)注*）的是共有的靶點(diǎn)，也就是說，黃色的靶點(diǎn)也是附子的靶點(diǎn)，即甘草的靶點(diǎn)包含了附子的靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 附子-甘草配伍藥對(duì)成分靶點(diǎn)和慢性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用（PPI圖制作）首先我們將差異基因與STRING數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，獲得差異基因的互作關(guān)系，并使用Cytoscape（http://www.cytoscape.org/）繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3、表1。

圖3 附子-甘草-CHF相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

表1 附子-甘草-CHF相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 計(jì)算PPI每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值對(duì)3個(gè)相互作用的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)合并后，共獲得節(jié)點(diǎn)154個(gè)，即附子-甘草對(duì)治療CHF的候選靶點(diǎn)共154個(gè)。見圖1。對(duì)候選靶點(diǎn)進(jìn)行度值（Degree）評(píng)價(jià)，計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值，選擇結(jié)果靠前的20條。見圖4。

圖4 部分候選靶點(diǎn)的度值

2.5 通路整合分析將上訴數(shù)據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行GO富集分析，GO富集分析結(jié)果主要包括分子功能、生物過程及細(xì)胞組成3個(gè)部分[15]。其中，在分子功能方面，附子配伍甘草主要是通過蛋白結(jié)合、核苷酸結(jié)合等方式對(duì)CHF產(chǎn)生保護(hù)作用；在生物過程方面，附子配伍甘草主要是通過抗凋亡、抗氧化、抗磷酸化等過程影響CHF的治療。結(jié)果中P值越小，表明該基因在GO中富集越多。見圖5、圖6。

圖5 附子-甘草配伍藥對(duì)候選靶點(diǎn)的部分GO富集分析（柱狀圖）

圖6 附子-甘草配伍藥對(duì)候選靶點(diǎn)的部分GO富集分析（氣泡圖）

2.6 KEGG通路分析在所篩選到的前20條通路中，包含有14條疾病相關(guān)通路及5條信號(hào)通路[腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、C型凝集素受體信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶、Th17細(xì)胞分化）]。見圖7、圖8。

圖7 附子-甘草配伍藥對(duì)候選靶點(diǎn)的部分KEGG通路分析（柱狀圖）

圖8 附子-甘草配伍藥對(duì)候選靶點(diǎn)的部分KEGG通路分析（氣泡圖）

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)學(xué)兩方面共同來解釋疾病發(fā)生發(fā)展過程的一種研究方法，該方法通過對(duì)中藥成分及作用靶點(diǎn)來探討附子配伍甘草治療CHF的可能機(jī)制。通過研究，我們發(fā)現(xiàn)附子-甘草配伍藥對(duì)共收集到81個(gè)化合物，對(duì)應(yīng)的成分靶點(diǎn)為169個(gè)，同時(shí)通過對(duì)CHF的檢索得到8 668個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，通過制作韋恩圖了解到附子-甘草配伍藥對(duì)的潛在靶點(diǎn)與CHF的疾病靶點(diǎn)有154個(gè)交集。我們?cè)趯?duì)篩選的154個(gè)候選靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗氧化過程與治療CHF的關(guān)系密切。已經(jīng)有研究者發(fā)現(xiàn)CHF大鼠的心肌氧化損傷增加，而通過抗心肌氧化損傷可以發(fā)揮對(duì)CHF大鼠的心肌保護(hù)作用[16]。在CHF大鼠中黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase, XO）活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量升高，通過降低心臟XO活性及MDA含量，改善心肌水腫、壞死及纖維化損傷，改善CHF的病理變化，從而發(fā)揮抗CHF的作用[17]。同時(shí)了解到在冠心病導(dǎo)致的CHF患者中，ERK磷酸化水平提高，可通過抑制其磷酸化從而達(dá)到保護(hù)心肌組織、改善心功能的作用[18]。除此之外，在進(jìn)行KEGG通路注釋分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)TNF信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的P值較小，被顯著富集。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF在缺血、缺氧等病理?xiàng)l件的刺激下可顯著升高，同時(shí)可通過降低TNF水平減輕心力衰竭時(shí)心肌損傷程度[19]。同時(shí)，葉超等[20]通過對(duì)CHF患者的觀察了解到對(duì)TNF的抑制明顯利于患者的恢復(fù)，表明TNF在CHF的治療中具有重要意義。

我們知道，細(xì)胞凋亡途徑在CHF的治療中也起到至關(guān)重要的作用。有研究表明，在CHF病理過程中，細(xì)胞凋亡水平明顯升高，通過降低細(xì)胞凋亡水平，可在CHF大鼠體內(nèi)產(chǎn)生明顯的抗心衰效應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞病理損傷、改善心肌細(xì)胞功能[21]。同時(shí)也有研究表明可通過調(diào)節(jié)CHF時(shí)PTEN/Akt/mTOR和ERK1/2信號(hào)通路，改善心肌細(xì)胞凋亡水平，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[22]。

我們通過PPI度值的分析了解到AKT、IL-6、MAPK與CHF關(guān)系密切。眾所周知，AKT是重要的細(xì)胞因子，往往通過上游因子的調(diào)節(jié)進(jìn)而對(duì)下游因子產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用從而發(fā)揮作用。而Bcl2/Bax明顯受到PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，通過降低AKT磷酸化水平抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗CHF的作用[23]。同時(shí)也有研究表明，在大鼠CHF模型中，可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮抗CHF的作用[24]。通過調(diào)節(jié)PTEN/Akt/mTOR信號(hào)通路可抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗CHF的作用[22]。諸多研究均表明AKT在CHF的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。而白介素-6（IL-6）是體內(nèi)細(xì)胞因子的重要成員，它可刺激C反應(yīng)蛋白（CRP）的生成，是一種重要的炎癥介質(zhì)。在心肌細(xì)胞損傷時(shí)，IL-6的表達(dá)明顯上升，而通過降低IL-6的表達(dá)，可顯著改善心肌細(xì)胞功能，從而達(dá)到保護(hù)心肌的作用[25]。而鐘鳴等[26]通過探討CHF患者血清IL-6及TNF-α水平獲悉，在CHF患者血清中IL-6和TNF-α水平明顯增高，表示在CHF的發(fā)生發(fā)展過程中IL-6和TNF-α發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。在治療CHF的過程中，血清中TNF-α、IL-6水平在藥物的治療作用下顯著降低，說明炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6在CHF的發(fā)生發(fā)展過程中有非常重要的作用[27]。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路，幾乎與生物體中全部病理生理過程相關(guān)，尤其是氧化應(yīng)激等細(xì)胞反應(yīng)過程，在CHF模型大鼠中可見MAPK磷酸化水平升高，而抑制MAPK蛋白磷酸化，激活PPAR-γ通路，通過參與線粒體生物合成，可調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和質(zhì)量，促進(jìn)能量生成，改善心臟能量代謝，進(jìn)而減緩CHF的病理進(jìn)展[28]。但是也有研究表明，抑制MAPK/ERK1/2通路可能通過抑制心肌自噬過程，進(jìn)而在CHF模型大鼠中發(fā)揮心肌保護(hù)作用[29]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測了附子-甘草治療CHF的主要機(jī)制，推斷附子-甘草配伍藥對(duì)可能通過調(diào)節(jié)AKT、MAPK相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而影響IL-6、TNF等細(xì)胞因子的表達(dá)，改善心肌細(xì)胞凋亡水平，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。但由于所選數(shù)據(jù)庫的信息可能尚不夠完全，該研究也還存在一些局限性，需要在今后的研究中進(jìn)一步闡明附子配伍甘草活性成分的作用靶點(diǎn)，從而更深入地探討其對(duì)CHF的作用機(jī)制。