鹽炙杜仲對大鼠腎陽虛的影響及機制研究

程芬 楊長花 宋艷麗 杜蓓 劉峰 胡本祥

關鍵詞鹽炙杜仲;腎陽虛;大鼠;缺氧誘導因子1α;信號傳導及轉錄活化因子5

腎陽虛是我國傳統醫學的常見證型之一，多與素體陽虛、年老腎虧、久病不愈等因素密切相關[1]。研究發現，腎陽虛會導致患者出現骨質疏松、軟骨退變及生殖能力減退等多種病理性改變，如不及時治療會嚴重影響其生活質量[2]。目前，臨床尚無針對腎陽虛的系統治療藥物，只能進行基礎的對癥治療，所以相關治療藥物的研發是當前工作重點[1]。中醫理論認為，腎主水，腎陽虛的臨床表現主要呈小便清長等特征，故有學者結合現代醫學研究認為，腎陽虛與腎組織病理學變化有關[3]。杜仲可通過增強或提高腎陽虛小鼠抓力、肛溫、自主活動能力、睪丸和精囊腺指數，延長其游泳時間，降低其血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCR）水平，改善其血液學指標來改善其腎陽虛證之腰膝酸軟、性欲減退、畏寒、肢冷、精神萎靡、陽虛水泛以及腎精虧虛、肝氣虛弱所致的血液虧虛[4]。鹽炙杜仲對大鼠去卵巢所引起的骨質疏松癥有良好的干預作用，且鹽制品效果優于生品[5]。杜仲鹽炙后，能改變其大多數化學成分的結構，增加親脂性，從而促進其體內吸收，提高生物利用度[6]。然而目前鹽炙杜仲在腎陽虛方面的藥理作用及機制尚不明確。有研究報道，缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/信號轉導及轉錄活化因子5（signal transducer and activator of transcription5，STAT5）信號通路及相關蛋白的表達變化與腎陽虛的發病機制及患者預后密切相關，調控HIF-1 α和STAT5 蛋白的表達可能是治療腎陽虛的重要途徑和方法[7-8]。基于此，本研究擬初步探討鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠的干預作用及潛在機制，為鹽炙杜仲藥理作用的深入研究及腎陽虛治療藥物的研發提供新的思路和參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SD1-BS 型全自動生化分析儀（成都斯馬特科技公司）、Axio Imager M2m型倒置顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司）、ChemiDoc XRS型凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）、ST-960 型多功能酶標儀（上海科華實驗系統有限公司）、GL-20MS型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、DYCZ-30C型雙垂直電泳槽（北京海天友誠科技公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鹽炙杜仲（北京同仁堂制藥有限公司，批號1908161），經陜西中醫藥大學藥學院胡本祥教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.干燥樹皮的鹽制品;桂附地黃片[陽性對照藥，批號1806192，規格0.4 g（相當于總藥材1 g）]購自太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司;磷酸腺嘌呤片（批號1811271，規格10 mg）購自天津力生制藥股份有限公司;超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）檢測試劑盒（貨號S0103）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（貨號S0131M）、睪酮（testosterone，T）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號PT872）、RIPA蛋白裂解液（貨號P0013B）、超敏ECL化學發光試劑盒（貨號P0018M）、兔源HIF-1 α多克隆抗體（貨號PT872）、兔源甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（貨號AF7087）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗（貨號A0208）均購自上海碧云天生物科技有限公司;皮質醇（cortisol，COR）ELISA 試劑盒（貨號KB3114）購自上海恪敏生物科技有限公司;兔源STAT5 及磷酸化STAT5（phosphorylatedSTAT5，p-STAT5）多克隆抗體（ 貨號分別為ab16276、ab178941）均購自艾博抗（上海）貿易有限公司;蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液試劑盒（貨號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒（貨號WLA088）、聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒（貨號WLA071）均購自沈陽萬類生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為蒸餾水。

1.3 實驗動物

清潔級雄性SD 大鼠共90 只，6～8 周齡，體質量為180～200 g，購自西安交通大學醫學部實驗動物中心，使用許可證號為SYXK（陜）2018-001。所有大鼠均飼養在溫度（22±2）℃、相對濕度40%～60%的動物房內，自由攝食、飲水。本動物實驗方案經陜西國際商貿學院動物倫理委員會批準同意，批準號為201940。

2 方法

2.1 鹽炙杜仲混懸液的制備

取鹽炙杜仲300 g，粉碎，得粗粉，取適量，置于60%乙醇1 000 mL中，回流提取1.5 h×2 次，合并提取液，加熱濃縮制成質量濃度為3 g/mL（以生藥量計）的浸膏，備用。使用時，將上述浸膏用水稀釋成質量濃度分別為0.6、0.3、0.15 g/mL（以生藥量計）的混懸液。

2.2 造模與給藥

90 只大鼠適應性喂養1 周后，稱定其體質量（記為W1）。按體質量均衡和隨機數字表法分為正常對照組（15 只）和造模組（75 只）。除正常對照組外，其余大鼠每天上午灌胃腺嘌呤250 mg/kg 建立腎陽虛大鼠模型，連續給藥14 d[9]。根據中醫理論觀察大鼠是否出現如下癥狀：（1）精神萎靡、畏寒;（2）活動減少、蜷縮抱團;（3）大便溏稀、小便清長、肛周污穢;（4）體毛疏松、黯淡無光等。根據上述癥狀對各組大鼠腎陽虛癥候進行評分：未出現以上癥狀記0 分，出現1 項癥狀記1 分，出現2 項癥狀記2 分，出現3 項癥狀記3 分，出現4 項癥狀記4 分;以大鼠腎陽虛癥候評分大于0 分并伴有血清T 水平降低、COR水平升高視為造模成功[10]。造模完成后，將造模組大鼠隨機分為模型組、陽性對照組和鹽炙杜仲低、中、高劑量組，每組15 只。陽性對照組大鼠灌胃桂附地黃片混懸液2.5 g/kg（溶劑為水）[9]，鹽炙杜仲低、中、高劑量組大鼠分別灌胃鹽炙杜仲混懸液1.5、3、6 g/kg[11]，正常對照組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，每天1 次，連續給藥8周[10]。給藥結束后，對各組大鼠的腎陽虛癥候進行評分并再次稱定其體質量（記為W2）。

2.3 大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平測定

取材前，大鼠禁食不禁水12 h。末次給藥1 h 后，取大鼠眼眶靜脈叢血，于4 ℃下靜置4 h 后，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，用全自動生化分析儀測定血清中BUN、SCR水平;嚴格按照ELISA 試劑盒說明書方法操作，檢測血清中T、COR水平。

2.4 大鼠腎組織病理學檢查

取血后，大鼠頸椎脫臼處死，取腎組織適量，用中性甲醛固定后，浸蠟、切片（厚度5 μm），常規HE染色后，使用倒置顯微鏡觀察其腎組織病理學變化。

2.5 大鼠腎組織中SOD活性、MDA水平檢測

取大鼠腎組織適量，嚴格按照試劑盒說明書方法操作，以WST-8 法檢測各組大鼠腎組織中SOD活性，顯色法檢測腎組織中MDA水平。

2.6 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA表達檢測

取大鼠腎組織適量，提取總RNA 后，逆轉錄成cDNA，采用熒光定量PCR 法檢測其HIF-1 α 、STAT5mRNA的表達水平。PCR 反應體系（20 μL）包含cDNA模版2 μL，PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，用無菌水補足20 μL。反應條件如下：94 ℃預變性3min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環。引物由賽默飛世爾科技有限公司設計、合成，其具體序列和擴增產物長度見表1。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，采用2-ΔΔCt法計算HIF-1α、STAT5 mRNA的相對表達量。

2.7 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5蛋白表達檢測

采用Western blot 法進行檢測。取大鼠腎組織適量，經RIPA蛋白裂解液提取總蛋白后，按BCA法定量，然后加熱變性，取變性后的蛋白樣品50 μg 進行電泳分離，隨后轉移至聚偏氟乙烯膜上，用脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后，置于4 ℃ 冰箱中，加入HIF-1 α 、STAT5、p-STAT5、GAPDH 一抗（稀釋比例均為1 ∶ 500），孵育過夜;使用PBST 緩沖液清洗3 次，共15 min，加入相應二抗（稀釋比例為1 ∶1 000），室溫孵育1 h，用PBST緩沖液清洗3 次，以ECL 顯色后，于凝膠成像儀上成像并使用Image J 1.52v 軟件分析蛋白灰度值，以目標蛋白與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值為該蛋白的相對表達量，以p-STAT5 與STAT5 的灰度值比值（p-STAT5/STAT5）評價STAT5蛋白的磷酸化水平。

2.8 統計學方法

應用SPSS 20.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料（符合正態分布）以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 大鼠體質量變化及腎陽虛癥候評分

鹽炙杜仲對大鼠體質量及腎陽虛癥候評分的影響見表2。由表2 可見，造模前，各組大鼠體質量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。給藥結束后，模型組大鼠的體質量較正常對照組顯著降低（P<0.05），腎陽虛癥候評分顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠的體質量均較模型組顯著升高（P<0.05），腎陽虛癥候評分均顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.2 大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平變化

鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平的影響見表3。由表3 可見，模型組大鼠血清中BUN、SCR、COR 水平均較正常對照組顯著升高（P<0.05），T水平顯著降低（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠血清中BUN、SCR、COR水平均較模型組顯著降低（P<0.05），T水平均顯著升高（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.3 大鼠腎組織病理變化

各組大鼠腎組織病理檢查的顯微圖見圖1。由圖1可見，正常對照組大鼠腎組織細胞排列整齊，未見明顯病理改變;與正常對照組比較，模型組大鼠腎小管壞死，腎小球數量減少、囊腔增大，炎癥細胞增生;與模型組比較，鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠腎小球及腎小管的病理改變均有所恢復，腎組織細胞排列均較為整齊，炎癥細胞浸潤均明顯減輕。

3.4 大鼠腎組織中SOD活性、MDA水平變化

鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠腎組織中SOD活性、MDA水平的影響見表4。由表4 可見，模型組大鼠腎組織中SOD活性較正常對照組顯著降低（P<0.05），MDA水平顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠腎組織中SOD 活性均較模型組顯著升高（P<0.05），MDA水平均顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.5 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA相對表達量變化

鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5mRNA相對表達量的影響見表5。由表5 可見，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA的相對表達量均較正常對照組顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA的相對表達量均較模型組顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.6 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5蛋白表達變化

各組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白表達的電泳圖見圖2，鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠腎組織中HIF-1 α、STAT5、p-STAT5 蛋白相對表達量和p-STAT5/STAT5 的影響見表6。由圖2、表6 可見，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白的相對表達量和p-STAT5/STAT5 均較正常對照組顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白的相對表達量和p-STAT5/STAT均較模型組顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

4 討論

中醫理論認為，腎陽虛是由機體腎陽虛衰、溫煦失職、氣化失權等病因所導致的畏寒怕冷、精神不振等一系列癥候[12-13]。現代醫學研究發現，腎陽虛發病機制與腦、腎、性腺等組織器官神經內分泌紊亂等因素相關[14]。腺嘌呤致腎陽虛是目前實驗室常用的腎陽虛動物模型建立方法，經實踐證實，該方法具有操作簡便、安全性及重復性較好的優點[15]。桂附地黃片是臨床應用較為廣泛的腎陽虛治療藥物，故本研究將其作為陽性對照藥。

杜仲為杜仲科植物杜仲E. ulmoides Oliv.的干燥樹皮，最早記載于我國傳統醫學著作《神農本草經》，具有強筋壯骨、補益肝腎等功效，可用于治療腎陽虛致腰膝酸痛等癥[16]。鹽炙杜仲是杜仲藥材經一系列加工工藝所制得的中藥炮制品，與傳統杜仲藥材相比，鹽炙杜仲具有更強的抗氧化能力，并可緩和生品藥性[17]。

腎陽虛癥候評分是研究者對腎陽虛大鼠造模效果評價及藥效學評價的重要手段之一[18]。BUN、SCR水平是反映腎功能的重要指標，其水平升高提示腎功能下降[19]。近年來有學者提出，下丘腦-垂體-性腺軸相關激素水平能夠反映腎陽虛疾病狀態及病情進展，血清中T、COR水平是下丘腦-垂體-性腺軸相關激素的代表，血清中T 水平降低及COR水平升高則是腎陽虛的重要表現之一[20]。本研究結果表明，與模型組比較，鹽炙杜仲各劑量組大鼠腎小球及腎小管的病理改變均有所恢復，其腎陽虛癥候評分和血清中BUN、SCR、COR水平均顯著降低，血清中T 水平均顯著升高，且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性，提示該炮制品能劑量依賴性地改善腺嘌呤誘導的大鼠腎組織病理改變和下丘腦-垂體-性腺軸相關激素水平。

現代研究發現，HIF-1α與腎陽虛的發病機制及疾病進展密切相關[21]。陳琪琪等[22]研究顯示，腺嘌呤會引發大鼠腎動脈血管鈣化、腎小球萎縮及腎間質纖維化等腎組織病理改變，其機制可能與HIF-1α水平升高有關;孔翠文等[23]研究顯示，腺嘌呤可誘導大鼠腎組織缺氧損傷、腎纖維化改變以及腎組織中HIF-1α水平升高;賈云波等[24]研究顯示，降低HIF-1α水平能夠有效改善腎陽虛大鼠的血瘀證。STAT5 蛋白在生殖細胞發育和性激素水平調節的過程中有重要意義，其表達的上調會造成機體性激素水平的異常[25]。本研究結果表明，經鹽炙杜仲干預后，腎陽虛大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA及HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白的相對表達量和p-STAT5/STAT5 均顯著降低，表明鹽炙杜仲不僅能顯著降低HIF-1α水平，還能夠顯著降低STAT5 蛋白的表達水平及其磷酸化水平，提示鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠的改善作用可能是通過下調HIF-1α和STAT5蛋白的表達來實現的。

SOD及MDA是體現抗氧化應激能力的指標。研究表明，SOD活性降低、MDA水平升高均會導致腎組織處于氧化應激損傷狀態，同時導致腎組織中HIF-1α水平升高[26];馮杰等[27]研究顯示，抑制MDA的產生和增強SOD的活性，可抑制腎組織中HIF-1α的表達水平，從而修復實驗動物的腎組織損傷。本研究結果表明，不同劑量的鹽炙杜仲均能增強大鼠腎組織中SOD活性并降低MDA水平，提示鹽炙杜仲能夠通過提高大鼠的抗氧化應激能力進而修復腎陽虛大鼠的腎組織損傷，同時抑制HIF-1α的表達。

綜上所述，鹽炙杜仲能夠明顯緩解腎陽虛大鼠的腎組織損傷，降低血清中BUN、SCR、COR水平，升高血清中T 水平，其機制可能與抗氧化應激、抑制HIF-1 α和STAT5 蛋白的表達有關。