“獨活-桑寄生”藥對治療膝骨性關節炎的藥理學及分子對接分析

李家豪 謝芳 劉曉嵐

（1 湖南中醫藥大學 長沙 410208；2 湖南省中醫藥研究院附屬醫院 長沙 410006；3 湖南中醫藥大學第二附屬醫院 長沙 410005）

骨性關節炎（Osteoarthritis, OA）是常見的退行性骨關節病，其發病與年齡、肥胖、性別、體質量以及外傷等多種因素有關[1～3]。OA 的病變常累及整個關節，如滑膜增生、骨贅形成、軟骨下骨硬化，而進行性關節軟骨破壞和細胞外基質合成代謝及分解代謝不平衡造成的軟骨流失是最主要的病理表現[4～5]。據統計，在OA 發病人群中，膝骨性關節炎（Knee Osteoarthritis, KOA）發病率高達45%，遠遠高于其他類型的 OA，故 KOA 是最主要的 OA 類型[6～7]。KOA 主要的臨床表現為膝關節疼痛、關節僵硬腫脹、關節周圍肌肉力量及功能下降[8～9]，是導致中老年人殘疾的主要原因之一[10]。有研究表明，KOA 影響著全球約2.5 億人的生活，每年帶來的醫療開支超過 891 億美元[11～12]，可見 KOA 不僅嚴重危害人類健康，還給社會經濟造成巨大負擔。然而，由于KOA的發病機制非常復雜，到目前為止，臨床仍然缺乏治愈KOA 或完全阻止KOA 疾病發展的方法[13]。西醫從KOA 的病理特點出發，形成了以抗炎止痛、營養關節軟骨及手術干預的系統治療方案，能在一定程度上緩解疼痛和改善膝關節活動度，但也存在遠期療效不佳、手術風險及后遺癥等不足之處[14]。中醫治療KOA 有獨特的認識，針對KOA 的發病特點及臨床癥狀表現形成了以補益肝腎、活血化瘀為代表的治療方法和理論體系。中醫藥治療KOA 臨床療效確切，在臨床中應用廣泛，且患者的接受程度較高。

獨活與桑寄生是獨活寄生湯中的經典藥對，廣泛應用于肝腎不足型KOA 的治療。邵先舫教授以獨活寄生湯為基礎，結合自己臨床用藥經驗創制的活膝湯在KOA 治療的臨床應用中，療效優良，其組方中也采用“獨活-桑寄生”藥對，配伍以奏祛風除濕、補益肝腎之效，協同發揮治療KOA 的作用。由于天然藥物調控機制的復雜性，“獨活與桑寄生”對KOA 的具體調控機制仍有待我們探索與研究。網絡藥理學是在系統生物學的理論基礎上，利用數據網絡分析生物系統和藥物分子的新型學科[15]。2007年，李梢提出生物網絡與中藥方劑兩者相結合的觀點[16]，隨著醫學科學的日益發展，人們發現基于網絡藥理學識別藥物中的化合物成分及靶點，能更準確合理地指導藥物在臨床治療中使用。近年來，網絡藥理學成為了一種可以系統、有效揭示中醫藥方劑中分子作用機制的方法[17]。本研究以網絡藥理學技術為依據，探討獨活與桑寄生的有效成分、潛在的作用機制及靶點，預測獨活與桑寄生干預KOA 的潛在靶點及作用機制，為“獨活-桑寄生”藥對防治KOA的進一步研究提供依據和借鑒。現報道如下：

1 工具與方法

1.1 藥對的活性成分及作用靶點篩選 基于TCMSP 數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），檢索出獨活與桑寄生的藥物活性成分，篩選出類藥性（Drug-likeness,DL）≥0.18，且口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%的活性成分，同時查找得到相應的作用靶點。應用Perl 插件刪除重復靶點，得到獨活-桑寄生藥對有效成分作用靶點。

1.2 KOA 作用靶點篩選 以“Knee Osteoarthritis”為檢索詞，在 GeneCards（https://www.genecards.org/）和 OMIM（https://www.omim.org/）數據庫中進行檢索，將條件設置為相關分數（Relevance Score）≥5 進行篩選，在 Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org/）中查找到相應的標準化疾病靶點。

1.3 藥物與KOA 的交集靶點篩選及蛋白互作網絡構建 應用R 軟件分析出藥物活性成分作用靶點與KOA 疾病靶點的交集，并以韋恩圖的方式呈現。將交集靶點導入STRING 數據庫（https://string-db.org/），蛋白種類的條件設置為“Homo Sapiens”，設置最低蛋白間互動分數的條件為0.7，構建藥物活性成分-KOA 交集靶點蛋白互作網絡（Protein-Protein Interaction,PPI），可得到 PPI 網絡圖，并基于 R 軟件計算出獲得交集靶點出現的頻次。

1.4 藥物-成分-KOA 靶點網絡構建 將篩選出的靶點導入Cytoscape 3.7.1 軟件，制作出藥物-活性成分-KOA 靶點網絡圖。圖中每個節點代表不同的有效成分或共同作用靶點，每條連線代表網絡中節點的相互關系。

1.5 Gene Ontology 富集分析和 KEGG Pathway 富集分析 在 Bioconductor 數據庫（http://www.bioconductor.org/）中下載相關數據，應用R 軟件對藥物與疾病共同作用靶點進行Gene Ontology（GO）富集分析和KEGG Pathway 富集分析，應用Perl 插件對部分結果進行轉化。

1.6 分子對接 從PDB 數據庫中查找并下載核心靶點蛋白的3D 結構，應用相應軟件對靶點及活性成分進行處理，然而導入AutoDockTools 中進行分子對接，藥物分子與靶點的結合能≤-5.0 kJ/mol 則被認為具有較好的結合活性。

2 結果

2.1 藥物有效成分與作用靶點 通過TCMSP 數據庫檢索得到獨活藥物活性成分99 種，篩選后得到9種有效成分。桑寄生藥物活性成分46 種，篩選后得到2 種有效成分。獨活活性成分作用靶點151個，桑寄生活性成分作用靶點93個。應用Perl 插件篩選并剔除重復部分得到獨活與桑寄生有效成分作用靶點151個。其中編號為MOL004782 的分子尚未發現作用靶點。“獨活-桑寄生”藥物有效成分與靶點數見表1。

表1 獨活-桑寄生藥物有效成分與靶點數

2.2 KOA 作用靶點篩選 以“Knee Osteoarthritis”為關鍵詞，相關性分數≥5 為篩選條件，在GeneCards 和OMIM 數據庫中查找到KOA 的疾病靶點共為2 261個。

2.3 藥物-活性成分-KOA 交集靶點互作網絡 應用R 軟件對比2 261個KOA 靶點與151個藥物有效成分作用靶點，篩選出94個共同作用靶點并畫出韋恩圖，得到的韋恩圖見圖1。采用Cytoscape 3.7.1軟件構建可視網絡圖，在藥物-有效成分-KOA 交集靶點互作網絡圖中，共獲得96個節點和134 條邊。見圖2。藥對中各活性成分與KOA 疾病交集靶點的Degree 值見表2。

圖1 獨活-桑寄生活性成分靶點與KOA 疾病靶點韋恩圖

圖2 藥物-有效成分-KOA 交集靶點互作網絡

表2 藥物活性成分與KOA 交集靶點的Degree 值

2.4 PPI 網絡圖 在STRING 數據庫輸入94個共同靶點，構建PPI 網絡圖。見圖3。篩選出核心靶點，其中出現頻次較高的有 TNF、ILB、AKT1、TP53、MMP9、CASP3 等。見圖 4。

圖3 藥物-疾病交集靶點蛋白互作（PPI）圖

圖4 藥物-疾病交集靶點Degree 柱狀圖

2.5 GO 富集分析與KEGG 富集分析 對共同作用靶點進行分子功能GO 富集分析，共得到2 064 條生物學功能條目，42 條細胞組成條目和122 條分子功能條目，各組分排名前10 的條目見圖5。對共同作用靶點進行KEGG 生物途徑富集分析，總共有148個不同生物途徑，排名前30 的生物途徑見圖6。其中排名前5 的包括：脂質與粥樣硬化、糖尿病并發癥中AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、白細胞介素-17 信號通路和腫瘤壞死因子信號通路。“獨活-桑寄生”干預KOA 的主要信號通路見圖7。

圖5 共同靶點GO 功能分析氣泡圖

圖6 KEGG 富集分析氣泡圖

圖7 “獨活-桑寄生”干預KOA 的主要信號通路

2.6 分子對接 將篩選到的核心靶點和“獨活-桑寄生”藥對中核心成分進行分子對接，結果表明該藥對的核心成分槲皮素可對核心靶點TNF、ILB 和AKT1 起作用，從而間接證實該藥對可通過調節TNF、ILB 和AKT1 靶點對KOA 起治療作用。見圖8。

圖8 “獨活-桑寄生”藥對核心靶點與KOA 的分子對接

3 討論

KOA 在中醫學中歸屬于“骨痹病”范疇。其發病通常與風寒濕邪侵襲、人體肝腎虧虛、瘀血阻絡有關。《素問·痹論篇》云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹……骨痹不已，復感于邪，內舍于腎。”同時《素問·上古天真論》中曰：“七八肝氣衰，筋不能動。八八天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極。”可見，隨著年齡增加，肝腎虧虛，正體不足，邪毒就容易侵襲人體，從而發生痹病。《張氏醫通》：“膝者筋之府，膝痛無不因肝腎虧虛者，虛則風寒濕氣襲之。”《證治準繩》亦云：“膝痛有風，有寒，有閃挫，有瘀血，有痰積，皆實也，腎虛其本也”，肝腎虧虛是KOA 發生的主要內因，風寒濕邪侵襲人體為外因。同時，也有一些醫家認為瘀血也是影響痹病的發病因素之一，《類證治裁·痹證》曰：“痹久必有瘀血”，《雜病源流犀燭》指出“痹者，閉也。三氣雜至，壅敝經絡，血氣不行，不能隨時祛散，故久而為痹。”王清任在《醫林改錯》中也提出“痹有瘀血”。由此可見本病肝腎虧虛是基礎，氣血瘀滯是關鍵，兼夾外感邪氣，屬于本虛標實證，治療當以補腎活血為主，輔以祛風散寒除濕[18]。

獨活歸屬腎、膀胱經，祛風除濕、宣痹止痛；桑寄生歸屬肝、腎經，補益肝腎、強筋壯骨。“獨活-桑寄生”常配伍用于補益肝腎、祛風除濕，是經典方獨活寄生湯中的藥對。在KOA 治療的中藥用藥規律分析中發現，這兩味藥在治療KOA 的臨床組方中應用較為廣泛。現代藥理學研究表明獨活乙醇提取物能夠抑制環氧化酶-1 及環氧化酶-2，具有良好的抗炎、鎮痛效果[19]。桑寄生具有祛風濕、補肝腎、強筋骨的作用，其祛風濕的作用可能與免疫抑制有關[20]。本研究基于網絡藥理學技術對“獨活-桑寄生”藥對干預KOA 的作用機制作了初步的數據挖掘。研究結果顯示“獨活-桑寄生”有效成分11 種，藥物有效成分已知的作用靶點151個，其中干預KOA 的潛在靶點 94個。最受關注的是槲皮素（quercetin，MOL000098），作用靶點多達 148個，其中與 KOA 相關的靶點多達88個。研究表明，槲皮素是一類雙黃酮類化合物，具有多種藥理作用，包括抗氧化、神經保護、抗病毒、抗癌、抗菌、抗炎、保肝、抗肥胖等[21～22]。在OA 的發展過程中，槲皮素能降低TNF-α、MMP3、MMP9、CCL2 的表達，在抗炎的同時抑制軟骨細胞外基質的降解[23]。湯喜蘭等[24]研究發現槲皮素對TNF-α、IL-6、IL-1β 的負性調節作用可能是通過抑制NF-κB 信號通路的激活完成。可見，槲皮素可能是“獨活-桑寄生”作用于KOA 的關鍵活性成分之一。同時，β-谷甾醇和谷甾醇也具有抗炎、抗氧化等作用，其對KOA 的治療作用也屢見報道。

“獨活-桑寄生”與KOA 共同作用靶點PPI 映射及分析得到出現頻次較多的靶點，如TNF、ILB、AKT1、TP53、MMP9、CASP3 等，這些可能是“獨活 -桑寄生”治療KOA 的潛在作用靶點。TNF 是一種常見的炎性細胞因子，在KOA 發病中有重要作用，中老年患者KOA 越嚴重則關節液中TNF-α 的含量水平越高[25]，通過降低關節中TNF-α 的含量能減輕關節炎癥，保護關節軟骨，從而延緩KOA 的病情進展[26]。同時，IL-1β 屬于白細胞介素分子家族，主要與炎癥反應有關，下調IL-1β 表達能有效抑制相關炎癥反應[27～28]。MMP9 屬于金屬基質蛋白酶家族，主導軟骨細胞外基質的降解，常常與IL6、TNF-α 等致炎因子協同促進關節軟骨的破壞[29]。此外，AKT1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究顯示AKT1 與細胞凋亡有關，抑制AKT1 的表達能促進軟骨細胞的凋亡[30～31]。

GO 富集分析與KEGG 富集分析結果顯示，上述共同作用靶點參與的生物活動主要涉及對脂多糖的反應、氧化應激反應及對細菌源性分子的反應等，并大多富集于脂質與粥樣硬化、糖尿病并發癥中AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、白細胞介素-17 信號通路和腫瘤壞死因子信號通路。 晚期糖基化終末產物（Advanced Glycosylation End Products, AGE） 及 其 受 體（Receptor of AGE,RAGE）的作用機制尚未完全明確。目前研究顯示AGE 主要在糖尿病患者體內高表達[32]，AGE-RAGE 能激活下游 NF-κB 信號通路，促進 IL-6、IL-8、TNF-α 等致炎因子的表達，激活的NF-κB 又能增加RAGE 的表達，形成正向的反饋調節[33]。除此之外，AGE-RAGE 還與 VEGF 的表達正相關，阻斷AGE-RAGE 的激活能抑制VEGF 的表達[34]。目前關于AGE-RAGE 信號通路的研究主要集中在糖尿病及心血管疾病方面，涉及OA 的研究較少。本研究KEGG 富集結果提示“獨活-桑寄生”干預KOA 的作用靶點與AGE-RAGE 信號通路高度相關，這為研究KOA 的發病機制提供了新的思路。而IL-17 和TNF 信號通路與KOA 的發病及病情進展密切相關，分子對接結果發現，“獨活-桑寄生”藥對中槲皮素能調節 ILB、TNF 和 AKT1 對 KOA 起治療作用，間接證實了該藥對具有調節ILB、TNF 和AKT1 靶點治療KOA 的潛在作用，但該分子機制仍需實驗進一步驗證。

綜上所述，“獨活-桑寄生”中11個有效成分，調控 IL6、TNF、AKT1 等 94個靶點，主要通過AGE-RAGE、TNF 和ILB 等信號通路干預KOA。本研究采用中藥藥理學分析，預測出“獨活-桑寄生”藥對治療KOA 的潛在作用機制，為進一步研究該藥治療KOA 的分子機制提供依據。同時，有利于進一步明確中藥復雜成分的主要活性成分及作用機理，為該藥對在KOA 的臨床治療中應用提供證據。