重癥流行性出血熱患者PBMC 中Fas/FasL 表達及免疫機制研究*

李珊

（福建省南平市第一醫院重癥醫學科 南平 353000）

流行性出血熱（Epidemic Hemorrhagic Fever,EHF）又稱腎綜合征出血熱，具有一定的地域性，山區多見。南平市地處閩北山區，各類嚙齒類動物比較多見，是漢坦病毒攜帶的宿主[1]。每年我市EHF 發病率比較高，漢坦病毒由于具有泛嗜性的特點，對各臟器均有致病力，所以容易導致多臟器功能障礙，如不及時辨別，極易進展為重癥病例[2]。況且本病臨床表現并不特異，容易誤診，往往錯過最佳治療時機[3]。免疫損傷機制是EHF 發病的重要機制之一，Fas/FasL 是介導各類細胞凋亡的重要途徑，但關于Fas 和FasL 在重癥EHF 患者不同階段外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC）中表達情況的研究尚較少見[4]。本研究探討Fas/FasL在漢坦病毒感染后機體中的表達情況及其免疫反應機制。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年4月至2021年4月在我院重癥監護室住院治療的50例重癥EHF 患者為研究對象。其中男 29例，女 21例；年齡 23～76 歲。研究對象嚴格根據病情分期進行分組，分為以下5組：發熱期組（Ⅰ期組）、低血壓休克期組（Ⅱ期組）、少尿期組（Ⅲ期組）、多尿期組（Ⅳ期組）和恢復期組（Ⅴ期組）。納入標準：符合1986年全國流行性出血熱會議制定的診斷標準，EHF 抗體IgM 陽性，具有典型的5 期經過，同時排除其他重癥疾病[5]。患者及其家屬對研究內容知情并簽署知情同意書。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準（編號：2017NO.03）。

1.2 設備和試劑 高糖DMEM 培養液（Gibco 公司，美國）；GIS 凝膠成像分析系統（瓦蘭科技有限公司，上海）；高速冷速離心機（昊諾斯科技有限公司，北京）；二氧化碳培養箱（沃信儀器有限公司，無錫）；人Fas 單克隆抗體、兔抗人FasL 單克隆抗體（譜析生科有限公司，上海）；PBMC 分離液（益普生物科技有限公司，武漢）；人腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的ELISA 試劑盒（心語生科有限公司，上海）。

1.3 PBMC 分離采集 分別抽取患者5 期的靜脈血8 ml（肝素抗凝），加入PBS 稀釋2 倍，混勻，將PBMC 分離液加入標本中，吸出單核細胞層，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，離心5 min，棄上清液，制成細胞懸液，采用高糖DMEM 培養液培養。

1.4 雙重吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）染色測PBMC凋亡 將PBMC 進行培養，根據不同培養時間（1 h、6 h、12 h 及24 h）觀察凋亡情況，然后給予AO/EB染色，按操作步驟進行固定、染色，最后使用熒光顯微鏡觀察。根據不同AO/EB 染色的顏色區別正常細胞、早期和晚期凋亡細胞。計算公式如下：PBMC 凋亡率＝（凋亡早期細胞+ 凋亡晚期細胞）/ 細胞總數×100%。

1.5 Western Blot 檢測Fas 和FasL 蛋白表達 使用分離液得到PBMC，配成細胞懸液，高糖DMEM 培養液培養24 h，培養后加入胰酶吹打消化，離心（1 000 r/min，10 min）獲得 PBMC 細胞，加入裂解緩沖液，離心（1 200 r/min，15 min）獲得蛋白，同時檢測所得蛋白的濃度。根據Western Blot 操作步驟：取樣、凝膠電泳分離、濕法轉膜、移至PVDF 膜上、封閉2 h、洗膜，然后加 Fas、FasL 和 GAPDH 一抗孵育（4℃過夜），TBST 洗 30 min，重復 3 次，加入二抗（辣根過氧化物酶標記）孵育2 h；最后曝光、顯影、定影；Bandscan 5.0 圖像分析出血熱患者各期蛋白的分子量，以Fas、FasL 與GAPDH 蛋白灰度值比值做結果。

1.6 RT-PCR 法檢測 Fas 和 FasL mRNA 表達 每組取 100 μl 的 PBMC 細胞懸液，加入 Trizol 裂解液（200 μl），提取總 RNA，使用分光光度計檢測 RNA濃度，按PCR 試劑盒步驟逆轉錄cDNA，將Fas 和FasL mRNA 的PCR 擴增產物進行電泳，最后用凝膠成像系統分析條帶。Genbank 庫查詢目標基因序列。見表1。

表1 Fas、FasL 和 β-actin 引物序列

1.7 ELISA 法檢測人 TNF-α 和 IL-6 水平 嚴格依據TNF-α 和IL-6 的酶聯試劑盒說明書操作。

1.8 觀察指標 比較各組PBMC 細胞凋亡率，外周血中 TNF-α、IL-6 水平，Fas、FasL 基因和蛋白表達水平。

1.9 統計學方法 采用SPSS24.0 軟件進行統計。各組計量資料符合正態分布以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重癥EHF 患者5 期PBMC 凋亡率 不同時間點Ⅰ期組、Ⅱ期組和Ⅲ期組PBMC 細胞凋亡率與Ⅳ期組、Ⅴ期組比較升高，尤其Ⅰ期組PBMC 凋亡率最高，各時間點組間比較有差異（1 h：F=29.12，P＜0.001；6 h：F=27.54，P＜0.001；12 h：F=25.23，P=0.003，24 h：F=18.17，P=0.005）。Ⅳ期組和Ⅴ期組比較提示兩組間的PBMC 凋亡率無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

表2 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 凋亡率（%，）

表2 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 凋亡率（%，）

分組 n 1 h 6 h 12 h 24 hⅠ期組Ⅱ期組Ⅲ期組Ⅳ期組Ⅴ期組50 50 50 50 50 28.34±6.76 19.46±4.88 10.54±2.87 4.28±1.12 3.75±0.87 24.25±6.13 17.57±3.93 8.69±2.74 4.03±1.31 3.43±0.61 19.46±4.68 16.11±3.58 6.83±1.39 3.68±0.87 3.23±0.59 15.36±3.18 12.35±3.16 4.81±1.32 3.54±0.68 2.92±0.51

2.2 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 中 Fas 和 FasL 蛋白表達 重癥EHF 患者前3 期組Fas 和FasL 蛋白表達水平與Ⅳ期組、Ⅴ期組比較明顯升高，組間差異均有 統 計 學 意 義 （Fas：F=36.43，P＜0.001；FasL：F=33.65，P＜0.001）；Ⅳ期組和Ⅴ期組的 Fas 和 FasL 蛋白表達均無顯著性差異（P＞0.05）。見圖1、表3。

圖1 重癥EHF 患者PBMC 中Fas 和FasL 蛋白表達

表3 5 期重癥 EHF 患者的 Fas 和 FasL 蛋白表達情況（ng/ml，）

表3 5 期重癥 EHF 患者的 Fas 和 FasL 蛋白表達情況（ng/ml，）

分組 n Fas FasLⅠ期組Ⅱ期組Ⅲ期組Ⅳ期組Ⅴ期組50 50 50 50 50 1.23±0.36 0.77±0.18 0.41±0.11 0.26±0.08 0.14±0.05 1.19±0.32 0.81±0.21 0.52±0.13 0.31±0.09 0.19±0.07

2.3 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 中 Fas 和 FasL mRNA 表達 RT-PCR 結果顯示 Fas 和 FasL mRNA在Ⅰ期組、Ⅱ期組、Ⅲ期組中均呈高表達，而Ⅳ期組和Ⅴ期組中表達量比較低，組間比較具有統計學差異（Fas：F=15.89，P=0.007；FasL：F=14.54，P=0.011）；Ⅳ期組和Ⅴ期組的Fas 和FasL mRNA 表達均無統計學差異（P＞0.05）。見表4。

表4 5 期重癥 EHF 患者的 Fas 和 FasLmRNA 表達情況（ng/ml，）

分組 n Fas FasLⅠ期組Ⅱ期組Ⅲ期組Ⅳ期組Ⅴ期組50 50 50 50 50 9.32±2.34 7.63±1.56 5.24±1.24 2.38±0.39 1.84±0.25 11.67±3.38 9.79±2.53 6.32±1.89 2.67±0.44 1.99±0.41

2.4 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 中 TNF-α 和 IL-6表達 前3 期組TNF-α 和IL-6 表達水平與Ⅴ期組比較明顯升高，尤其是Ⅰ期組致炎因子水平最高，Ⅳ期組表達量水平相對較低，組間差異有統計學意義（TNF-α：F=42.35，P＜0.001；IL-6：F=31.27，P＜0.001）。見表5。

表5 重癥 EHF 患者 PBMC 中 TNF-α 和 IL-6 表達（μmol/L，）

分組 n TNF-α IL-6Ⅰ期組Ⅱ期組Ⅲ期組Ⅳ期組Ⅴ期組50 50 50 50 50 115.32±21.34 101.63±18.56 93.24±16.74 65.38±14.26 34.64±7.47 123.45±5.67 97.45±24.21 89.45±16.79 67.32±13.47 23.34±4.98

3 討論

南平地區處于山區，EHF 實質上是一種地域性疾病，十個縣市患者臨床特點無明顯差異，病毒基本來源同一種屬，病毒致病力相似[6]。大多數重癥患者具有典型5 期表現，部分患者可出現多期重疊表現，主要的表現是發熱、充血、出血、腎功能異常、低血壓，甚至少尿、無尿、休克等[7～8]。漢坦病毒是一種有包膜的負鏈RNA 病毒（包括L、M 和S 3個基因組），屬布尼亞病毒科，可以編碼核蛋白、G 糖蛋白、L聚合酶蛋白[9～10]。已經證實病毒的直接致病是主要發病機制，腎臟是主要靶器官，在早期階段即會出現原發性損傷，但對免疫損傷機制仍有待探索。

本研究發現重癥EHF 患者各期外周血PBMC的Fas 表達升高，尤其是前期階段，與恢復期的患者比較具有顯著性，發熱期患者Fas 表達明顯最強，隨著病程的推移，表達也逐漸下降，重癥EHF 患者各期之間存在差異。重癥EHF 患者外周血PBMC 中FasL 的表達在發熱期、低血壓休克期、少尿期也明顯增強，而在多尿期、恢復期患者表達相對較低。有研究表明，FasL 在T 淋巴細胞表達量明顯[11]，FasL可以與Fas 進行結合，相互結合后機體對Fas+靶細胞發揮細胞毒的生物活性，從而反饋性引起免疫細胞凋亡。

重癥EHF 患者病程早期PBMC 凋亡率最高，而且血涂片中會發現大量異型淋巴細胞，實質上也是一種免疫活化的淋巴細胞，在細胞免疫中起著重要的作用，參與機體的免疫損傷[12～13]。我們亦發現早期外周血PBMC 中Fas 和FasL 的表達均明顯增強，與漢坦病毒全身血癥的級聯爆發時間相吻合，隨著病程進展，在疾病的多尿期和恢復期，兩者PBMC細胞凋亡率無顯著性差異（P＞0.05）。重癥EHF 患者不同時期的TNF-α 和IL-6 表達水平也有所不同，均較恢復期的患者炎癥水平高，尤其是發熱期的患者炎癥指標升高最明顯，也提示我們要遵循早診斷、早治療的原則，早期控制本病對防止重癥化是非常關鍵的[14～15]。

綜上所述，Fas、FasL 濃度高低與機體損害的程度有關，該途徑可能介導重癥EHF 患者5 期發展的致病過程，對外周血單個核細胞具有免疫調控作用；如果能有效抑制Fas/FasL 途徑，可以減輕免疫損傷，對改善病毒血癥反應具有一定的臨床價值。