固定酶底物法測(cè)定生活飲用水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌精密度分析

雷靜 廖爽 喬茜茜 呂警

摘???要：總大腸菌群目前作為評(píng)價(jià)水質(zhì)的一項(xiàng)指標(biāo)，是反映水樣是否受到糞便污染的指標(biāo)。固定酶底物法是從美國(guó)引進(jìn)的一種大腸桿菌新型檢測(cè)方法。該方法采用酶底物法測(cè)定生活飲用水中的總大腸菌群、大腸埃希氏菌，分析了不同濃度水樣的精密度，低濃度水樣的精密度為，1.6%、2.0%;中濃度水樣的精密度為1.3%、1.8%;高濃度水樣的精密度為2.0%、4.3%;陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株的精密度均為0.86%。

關(guān)鍵詞：酶底物法???總大腸菌群???大腸埃希氏菌???精密度

中圖分類號(hào)：R123???????????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A???????????文章編號(hào)：1672-3791（2022）07（b）-0000-00

Precision?Analysis?of?Total?Coliform?group?and?Escherichia?Coli?in?Drinking?Water by?Enzyme?Substrate?Method

LEI?Jing1 LIAO?Shuang1??QIAO?Qianqian1 LYU?Jing2*

（1.Xinjiang?Changyuan?Water?Science?Research?Institute?Co.?Ltd.;2.Quality?and?Safety?Testing?Center?of?Urumqi?Agricultural?Products，?Urumqi，?XinJiang?Uygur?Autonomous?Region，?830000?China）

Abstract：?Total?coliform?group?is?currently?used?as?an?index?to?evaluate?water?quality，?which?is?an?indicator?of?whether?the?water?sample?is?contaminated?by?feces.?Enzyme?substrate?method?is?a?new?detection?technology.?This?method?uses?enzyme?substrate?method?to?determine?the?total?coliform?group?and?Escherichia?coli?in?drinking?water，?and?analyzes?the?precision?of?different?concentrations?of?water?samples.?The?precision?of?low?concentration?of?water?samples?is?1.6%?and?2.0%.?The?precision?of?medium?concentration?water?sample?was?1.3%?and?1.8%.?The?precision?of?high?concentration?water?sample?was?2.0%?and?4.3%.The?precision?of?positive?standard?strains?was?0.86%.

Key?Words：?Enzyme?substrate?method;?Total?coliform;?Escherichia?coli;?Precision

微生物常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)為總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌。它們均可作為檢驗(yàn)?zāi)c道致病菌的指示菌，是進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。總大腸菌群是指一群在37?℃培養(yǎng)24?h，能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌[1]。總大腸菌群目前作為評(píng)價(jià)水質(zhì)的一項(xiàng)指標(biāo)，是反映水樣是否受到糞便污染的指標(biāo)[2]。生活飲用水中針對(duì)大腸菌群、大腸埃希菌等的檢測(cè)技術(shù)主要包括乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法、濾膜法、固體酶底物法[3]?，其中多管發(fā)酵法為仲裁法[4]。固定酶底物法[5]是從美國(guó)引進(jìn)我國(guó)的一種大腸桿菌檢測(cè)方法，此方法簡(jiǎn)單、方便、快速、無培養(yǎng)基的制作與干擾等優(yōu)點(diǎn)[6]。目前被美國(guó)、歐洲及大部分亞洲國(guó)家廣泛應(yīng)用于水中總大腸菌群、糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）及大腸埃希氏菌的檢測(cè)。并通過美國(guó)EPA、《水與廢水標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法》以及我國(guó)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》認(rèn)證[7]。

1????實(shí)驗(yàn)部分

1.1??材料與試劑

1.1.1試劑

在該實(shí)驗(yàn)中酶底物法所用酶底物法檢測(cè)試劑?MMO-MUG培養(yǎng)基，無菌定量瓶（帶100?mL刻度），51孔定量檢測(cè)盤均購(gòu)買于西安立科環(huán)保科技有限公司。

1.1.2儀器設(shè)備

隔水式恒溫培養(yǎng)箱型號(hào)：GHP-9270，高壓蒸汽滅菌器型號(hào)：LDZX-50KBS，程控定量封口機(jī)型號(hào)：LK-2010，手提式暗箱紫外分析儀型號(hào)：ZK-5。

1.1.3??標(biāo)準(zhǔn)菌株

陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌菌種號(hào)CMCC（B）44102?來源：南京便診生物科技有限公司;陰性標(biāo)準(zhǔn)菌株：銅綠假單胞菌菌種號(hào)CICC?21636來源：中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心。

1.2???試驗(yàn)方法

用無菌定量瓶量取100?mL水樣（或稀釋后水樣），將2.?7?g?M?M?O-M?U?G培養(yǎng)基加入待測(cè)水樣中，使其完全溶解，混合均勻，然后將100?mL水樣全部倒入51孔無菌定量盤內(nèi)，用手撫平定量盤背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，用程控定量封口機(jī)封口，放入（37±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h（如顯色不明顯可延長(zhǎng)至28?h）。將培養(yǎng)24?h后的定量盤取出觀察，如孔格內(nèi)水樣變黃則說明該孔內(nèi)含有大腸菌群，將培養(yǎng)24?h后的定量盤放置于波長(zhǎng)366?nm?紫外光下照射，有熒光的孔格說明該孔內(nèi)含有大腸埃希氏菌。最后計(jì)算變黃或變黃且有熒光的孔數(shù)對(duì)照酶底物法51孔最可能數(shù)（MPN）表，查出其代表的總大腸菌群或大腸埃希氏菌最可能數(shù)[8]。

2???結(jié)果與分析

2.1低濃度水樣檢測(cè)結(jié)果

如表2所示，通過預(yù)試驗(yàn)選擇的中濃度水樣進(jìn)行了6次平行檢測(cè)，樣品稀釋10倍，總大腸菌群、大腸埃希氏菌平行檢測(cè)結(jié)果有了一些差異，精密度分別為1.3%、1.8%。

2.3??高濃度水樣檢測(cè)結(jié)果

如表3所示，通過預(yù)試驗(yàn)選擇的高濃度水樣進(jìn)行了6次平行檢測(cè)，樣品稀釋10?000倍，總大腸菌群、大腸埃希氏菌平行檢測(cè)結(jié)果差異比低濃度和中濃度要大，精密度分別為2.0%、4.3%。

2.4陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液檢測(cè)結(jié)果

如表4所示，將已復(fù)活復(fù)壯的陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株配制成1麥?zhǔn)媳葷岫鹊木鷳乙海?xì)菌約為3×108?cfu/mL，再將菌懸液稀釋108倍再進(jìn)6次平行行檢測(cè)。精密度均為0.86%，因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)中所使用的陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌，可以作為總大腸菌群的陽性指示菌，故總大腸菌群、大腸埃希氏菌平行檢測(cè)結(jié)果一致，精密度也一致。

2.5?陰性及空白對(duì)照

陰性對(duì)照試驗(yàn)參照陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，經(jīng)24?h培養(yǎng)后，陰性對(duì)照的51孔定量盤樣品的顏色未發(fā)生變化，呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，該次樣品測(cè)定結(jié)果有效。測(cè)定總大腸菌群、大腸埃希氏菌空白時(shí)，用無菌水代替試樣參照陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法經(jīng)24?h培養(yǎng)后的?51?孔定量盤均無任何顏色反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果滿足實(shí)驗(yàn)要求。

3??結(jié)果與討論

該次實(shí)驗(yàn)總大腸菌群精密度檢測(cè)結(jié)果為?1.3%≤RSD≤2.0%?;大腸埃希氏菌精密度檢測(cè)結(jié)果為?1.8%≤RSD≤4.3%。固定酶底物法操作方便，檢測(cè)時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間都較短，而且不需要確認(rèn)試驗(yàn)，能夠?qū)λ畼又械奈⑸镂廴厩闆r進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)和判斷;能夠同時(shí)檢測(cè)大腸菌群和具有病原學(xué)意義的大腸埃希氏菌，特異性較高，靈敏高，可以很大程度降低實(shí)驗(yàn)過程中引入的污染，避免了二次污染的發(fā)生，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境要求較低，不需要嚴(yán)格的無菌環(huán)境，對(duì)監(jiān)測(cè)人員技術(shù)能力要求降低。酶底物法很好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法在檢測(cè)時(shí)間、靈敏度上的不足，可以很好地應(yīng)用在生活飲用水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的檢測(cè)，替代傳統(tǒng)方法成為微生物檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

[4]?樓小平，林增飛.多管發(fā)酵法和酶底物法檢測(cè)總大腸菌群的結(jié)果差異性[J].凈水技術(shù)，2020，39（6）：14-17，37.

[5] 張曉華，高瑞紅，王驥濤，等.酶底物法檢測(cè)水中菌落總數(shù)的效果評(píng)價(jià)[J].山西醫(yī)藥雜志，2020，49（12）：1491-1492.

[6] 黃利美，黃錦婷，楊穎.酶底物法與多管發(fā)酵法檢測(cè)大腸菌群的方法探討[J].飲食保健，2018，5（1）：260.

[7]? 楊曉冉，朱超，張付海，等.固定酶底物法測(cè)定水中糞大腸菌群的優(yōu)點(diǎn)及影響因素[J].環(huán)境科學(xué)導(dǎo)刊，2017，36（5）：87-90.

[8] 羅勻.水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）兩種檢測(cè)方法的比較研究[J/OL].城市建設(shè)理論研究（電子版）：551-555[2013-06-15].https：//wenku.baidu.com/view/b6ad7bc019e8b8f67c1cb952？fr=xueshu.