飼料中添加凝結芽孢桿菌的評估

柳成東 ，吳有林 ，肖俊峰 ，肖麗萍 ，蔡 冬 ，梁世仁 ，丁能水 ，4

（1.福建傲農生物科技集團股份有限公司，福建 漳州 363000；2.福建省生豬營養與飼料重點實驗室，福建 漳州 363000；3.福建傲農生物制藥有限公司，福建 漳州 363000；4.江西農業大學豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室，江西 南昌330045）

近年來，隨著禁止在飼料中添加促生長藥物飼料添加劑的研究，對飼用益生菌的研究越來越受到飼料行業的關注。凝結芽孢桿菌作為唯一1 株具有芽孢體，能夠分泌乳酸的飼用益生菌，成為當前的研究熱點。已有研究表明，凝結芽孢桿菌能夠調節畜禽腸道菌群，改善畜禽生長性能。與此同時，也有研究表明凝結芽孢桿菌與其他商業益生菌組合飼喂效果低于單一飼喂凝結芽孢桿菌的效果。因此，如何科學、合理地評估凝結芽孢桿菌在飼料添加劑中的運用效果，需要建立一套較為合理、有效體外評估體系。

一般而言，飼用益生菌在畜禽生產中的應用，往往面臨飼料加工過程中高溫，畜禽腸道酸性環境，及胃中膽鹽的挑戰。同時，抑菌性能作為益生菌發揮益生功能的重要指標，對抑制畜禽腸道有害菌，以及飼料源中的有害菌—金黃色葡萄球菌有重要的作用。此外，通過抑菌效果能夠有效評估益生菌之間的頡頏作用，進而選擇合理的有效組合方案。飼用益生菌應用于畜禽體內時，應該注意益生菌在發揮益生菌功能，更應該關注益生菌是否會對畜禽體內供氧和提供養料的紅細胞造成損傷。據此，文章以凝結芽孢桿菌為研究對象，通過體外評估的方法，說明飼用益生菌能夠作為飼料添加劑在畜禽養殖、飼料和飼料添加劑生產企業中的運用提供體外評估思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

凝結芽孢桿菌（YNAU 3127）選自云南當地品種“大河豬”腸道中分離、純化的菌株，經溶血實驗評估后，表明該株凝結芽孢桿菌具有可靠的安全性；在保證對畜禽本身無損傷的基礎上評估其耐受性和抑菌性能。

指 示 菌： 大 腸 桿 菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）； 金 黃 色葡萄球菌（Staphylococcus aureusBNCC186335）；枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilisATCC PTA-6737）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisbio-58806）、丁酸梭菌（Clostridium b u t y r i c u mB N C C 3 3 7 2 3 9）、屎腸球菌（Enterococcus faeciumbio-67122）、糞腸球菌（Enterococcus faecalisBNCC192631）、 酵 母 菌（Candida utiliBNCC336517）。以上菌株均購買自北納創聯生物科技有限公司和北京百歐博偉生物科技有限公司。

1.2 實驗試劑

MRS 培養基（g/L）：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、牛肉膏5 g、葡萄糖5 g（無需分開滅菌）、氯化鈉（NaCl）2.5 g、氯化鈣（CaCl2）0.15 g、一水硫酸錳（MnSO4·H2O）0.1 g、番茄粉0.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。用于凝結芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌和酵母菌的培養，以及凝結芽孢桿菌對大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌混合抑菌的液體培養基；和凝結芽孢桿菌對丁酸梭菌、屎腸球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和酵母菌的牛津杯法抑菌涂布培養基。

RCM 培養基（g/L）：酵母浸膏0.3 g、牛肉膏1 g、胰蛋白胨1 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.1 g、NaCl 0.5 g、三水合乙酸鈉0.3 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g，用于丁酸梭菌的培養。

LB 培養基（g/L）：酵母膏5 g、胰蛋白胨10 g、Nacl 10 g、蒸餾水1 000 mL。用于大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的培養。

血瓊脂培養基：在MRS 培養基的基礎上加入10%的無菌脫脂豬血。

分析試劑：豬膽鹽、鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）。

1.3 溶血實驗的評估實驗步驟

β- 溶血實驗設計如下：將大腸桿菌K88 具有溶血現象作為對照組，對比評估凝結芽孢桿菌（YNAU 3127）是否具有溶血現象。操作如下：將血瓊脂培養基倒入無菌二分塑料培養皿（購買于海門博大實驗器材廠），冷卻、凝固后在培養皿左右兩邊各放置一個牛津杯，并同時各加入100 μL 的ETEC K88菌液和凝結芽孢桿菌菌液，并置于恒溫培養箱中培養。培養24 h 后，通過觀察是否出現溶血圈，驗證該株凝結芽孢桿菌的安全性。

1.4 凝結芽孢桿菌耐受性實驗步驟

1.4.1 凝結芽孢桿菌耐高溫實驗步驟

將凝結芽孢桿菌培養液按2%的接種量接種到MRS 培養基中；分別取5 mL 到規格為10 mL 的無菌EP 管 中，置 于70 ℃、80 ℃和90℃的水浴鍋中處理10 min 后，采用平板計數法檢測菌落個數。

1.4.2 凝結芽孢桿菌耐酸實驗步驟

將配制MRS 液體培養基，分裝到250 mL 的三角錐瓶中，每瓶分裝100 mL；分裝后用70% HCl和30% NaOH 對其培養基進行酸堿調定，分別將pH 調到1、2、3、4、5、6、7，調完后121℃滅菌30 min。將凝結芽孢桿菌培養液按2%的接種量接種到MRS 培養基中，置于氣浴恒溫振蕩器（37℃、180 r/min）培養后，培養24 h，計數。

1.4.3 凝結芽孢桿菌耐膽鹽實驗步驟

分別稱取一定量的膽鹽加入到裝 有100 mL 的MRS 培 養 液，配制 成 含0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%濃度的MRS 培養液后，121℃滅菌30 min；待冷卻后，將凝結芽孢桿菌培養液按2%的接種量接種到MRS 培養液中，置于搖床（37℃、180 r/min）24 h 培養后，計數。

1.5 抑菌實驗步驟

1.5.1 共培養抑菌法

分別接種200 μL 的凝結芽孢桿菌和200 μL 的大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌到200 mL 的MRS 培養基中，置于搖床（37℃、180 r/min）24 h 培養后，分別采用平板計數大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌落數。

1.5.2 牛津杯法抑菌法

采用經典的牛津杯法評估凝結芽孢桿菌對商業益生菌的抑菌效果。具體操作如下：將凝結芽孢桿菌和商業益生菌分別接種于發酵培養基中，置于搖床（37 ℃、180 r/min）24 h 培養后；取200 μL 稀釋到10-2的商業益生菌的菌液均勻涂布到MRS 培養基上，涂干后，在培養基上放置一個牛津杯，加入100 μL的凝結芽孢桿菌菌液。然后，將培養皿放置37.5℃恒溫培養箱中培養24 h， 之后測定抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ）。每次操作，每個指示菌涂3 個培養皿（3 次平行測定），統計測定結果的平均值。

2 結果

2.1 凝結芽孢桿菌安全性評估實驗結果

由圖1 可見，在牛津杯中加入大腸桿菌K88 菌液的血瓊脂培養基平板上，出現了明顯的溶血圈（R）。在牛津杯中加入凝結芽孢桿菌的血瓊脂培養基平板上，無溶血圈（L），判定該株凝結芽孢桿菌對細胞的無破壞作用。

圖1 凝結芽孢桿菌溶血性實驗評估（β-溶血實驗）

2.2 凝結芽孢桿菌耐高溫性實驗結果

由表1 結果可知，該株凝結芽孢桿菌在70℃的高溫下存活率高達90.5%，在高溫90 ℃下，菌株存活率仍然高達51.2%，說明該株凝結芽孢桿菌在高溫下存活良好。

表1 凝結芽孢桿菌耐高溫的實驗結果 %

2.3 凝結芽孢桿菌耐酸性實驗結果

由表2 結果顯示，該株凝結芽孢桿菌在pH=3 的酸性環境下，存活率能夠達到14.25%。相反，當pH=6 的微酸性環境下，該株凝結芽孢桿菌存活率為155%。

表2 凝結芽孢桿菌耐酸性實驗結果 %

2.4 凝結芽孢桿菌耐膽鹽試驗結果

根據表3 結果可知，隨著膽鹽濃度的升高，該芽孢桿菌的存活率略有下降。當膽鹽濃度達到0.3%，凝結芽孢桿菌的存活率仍然在70.0%，表明該菌株對膽鹽有很強的耐受性。

2.5 凝結芽孢桿菌對有害菌的抑菌實驗結果

由表4 結果可知，凝結芽孢桿菌對雞白痢沙門氏菌的抑制作用最強；同時，對大腸桿菌K88 和金黃色葡萄球菌也有較好的抑制作用。

表4 凝結芽孢桿菌對有害菌的抑菌性能的實驗結果

2.6 凝結芽孢桿菌對商業益生菌的抑菌實驗結果

由表5 結果可知，凝結芽孢桿菌對不同商業益生菌之間抑菌效果差異顯著（P＜0.05）；其次，凝結芽孢桿菌對丁酸梭菌的抑制效果最佳。但對糞腸球菌和酵母菌無抑制效果。

表5 凝結芽孢桿菌對商業益生菌的抑菌的實驗結果 mm

3 討論

3.1 凝結芽孢桿菌溶血實驗安全評估

β-溶血實驗常用于體外評估菌株毒性及所產毒素對細胞及膜結構的破壞作用。因此，本研究運用β-溶血實驗驗證凝結芽孢桿菌是否對細胞的有破壞效果。圖1 顯示凝結芽孢桿菌對紅細胞無破壞作用，表明凝結芽孢桿菌無毒性和不產細菌毒素，可安全應用于飼料添加劑和畜禽養殖生產中。

3.2 凝結芽孢桿菌耐受性的評估影響

益生菌的耐受性能是依據實際生產過程中高溫制粒，畜禽腸道酸性環境和膽鹽破壞而進行的評估的指標。由耐受結果可知，該株凝結芽孢桿菌具有良好的耐高溫、耐酸和耐膽鹽的性能（表1、表2 和表3），這一結果與前人報道一致。這也驗證了飼用凝結芽孢桿菌在飼料生產環節中和畜禽腸道環境中能夠降低損耗。

表3 凝結芽孢桿菌豬膽鹽的耐受實驗結果 %

3.3 凝結芽孢桿菌對有害菌的抑制作用

大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌是引起豬只和雞腹瀉的主要致病菌，導致生產性能下降。同時，金黃色葡萄球菌是飼料及飼料原料中主要污染菌，常常會導致動物腸道和肝臟受到毒素的破壞，導致生產性能下降和死亡率增加。本研究顯示，凝結芽孢桿菌對大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果，這個結果與以往的報道基本一致。這說明，該株凝結芽孢桿菌能夠在飼料和畜禽養殖生產中運用，提高畜禽生長性能和對飼料有一定的保護作用。

3.4 凝結芽孢桿菌對商業益生菌的抑制作用

飼用益生菌添加符合我國實際34 種飼料添加劑的使用規范（《飼料添加劑品種目錄》，2020）。生產中常常以添加單一菌和組合菌的方式改善畜禽生長性能，滿足我國在研發禁用促生長藥物飼料添加劑的需求。本研究表明，該株凝結芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、丁酸梭菌和屎腸球菌具有抑菌效果；但對糞腸球菌和酵母菌無抑制作用，這一結果與前人報道一致。本實驗研究首次發現，凝結芽孢桿菌對益生菌丁酸梭菌也有一定的抑制作用。以上結果顯示，凝結芽孢桿菌在與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、丁酸梭菌、屎腸球菌組合使用過程需謹慎考慮。

4 結論

本研究考慮飼用益生菌凝結芽孢桿菌在運用過程中，首先要滿足菌株的安全性，進而對飼用凝結芽孢桿菌進行耐受性能測定，得出其符合飼用益生菌凝結芽孢桿菌在飼料工藝中和畜禽腸道中的運用依據；同時，驗證凝結芽孢桿菌的抑菌性能。這樣能夠更好地提供凝結芽孢桿菌在飼料和畜禽養殖中，以及飼料添加劑中益生菌之間的組合運用研究依據。