豬偽狂犬病病毒gE 基因缺失株毒株的鑒定

林 鷙,何錫忠,朱永軍,丁衛星,彭麗英

(上海市農業科學院畜牧獸醫研究所,上海 201106)

偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種急性傳染病[1],1813 年在美國的牛群中首次發現,1902 年匈牙利科學家Aujeszky 將其命名為‘Aujeszky disease’[2]。

偽狂犬病流行廣泛,已在40 多個國家或地區暴發。 1947 年我國首次報道了貓偽狂犬病,1956 年在哺乳豬群中發現偽狂犬病[3]。 經典的偽狂犬病毒可致母豬流產、不孕、死胎多,仔豬感染后多數一周內死亡。 與經典偽狂犬病毒相比,變異毒株毒力更強,且對各階段豬都有危害,對新生仔豬有100%致死率。豬只感染后會出現發熱、食欲不振、消瘦、腹瀉等癥狀,還有的先咳后喘,出現流鼻涕流眼淚等癥狀,常被誤認為氣喘病或感冒,導致未能及時有效采取措施[4-9]。 2011 年至今,由變異的豬偽狂犬病病毒引起的豬偽狂犬病在全國多數省份暴發,給豬場帶來很大的經濟損失。

PRV-gE基因是病毒復制的非必需基因,該基因的缺失可以降低病毒的嗜神經性且不影響免疫原性,可以用來區分野毒感染和疫苗免疫[10]。 傳統的疫苗已經不能完全抵擋變異毒株的侵襲,目前急需更新疫苗毒株[11]。 本研究將分離得到的PRV 變異毒株部分gE基因敲除[12]后進行純凈度、外源病毒檢測,特異性試驗,毒力試驗及免疫原性試驗,旨在評估構建的gE基因缺失毒株能否用于滅活疫苗的制備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

PRVSX-gE 基因缺失毒株(108.33TCID50∕mL)、攻毒用強毒株PRVBJ病毒(108.33TCID50∕mL,實驗室分離得到)、BVDV、CSFV 及PCV-2 均由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所保存。

1.1.2 細胞

STHN、PK15、MDBK 細胞由上海農業科學院畜牧獸醫研究所保存。

1.1.3 培養基

細胞用培養基DMEM、胰酶均購于GIBCO 公司;硫乙醇鹽流體培養基(TG)、胰酪大豆胨液體培養基(TSB)均購自中國獸醫藥品監察所;液體培養基和固體培養基均購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.4 熒光抗體檢測試劑盒

牛病毒性腹瀉∕黏膜病毒、豬圓環病毒2 型及豬瘟病毒間接熒光檢測試劑盒購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.5 偽狂犬病病毒特異性血清制備

根據TCID50測定結果將PRVSX-gE 株病毒濃度調整為108.33TCID50∕mL,0.02%BEI 滅活后加入2%的硫代硫酸鈉中和1 h,滅活病毒液接種ST 細胞,滅活檢驗合格后加入佐劑制備成滅活疫苗。 取5 頭28 日齡左右的仔豬(PRV 抗原陰性和gB-ELISA 抗體陰性)進行免疫,每頭接種2 mL,2 周后加強免疫一次,二免后56 d 采血,制備PRVSX-gE 特異性血清,于-80 ℃冰箱保存。

1.1.6 診斷試劑盒

PRV 的ELISA 診斷試劑盒購自美國IDEXX 公司。

1.1.7 實驗動物

PRV 抗體陰性仔豬(經試劑盒檢測陰性)購自江蘇某豬場。 體重20 g 左右SPF 級ICR 小鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PRVSX-gE 病毒傳代

將鑒定好的PRVSX-gE 株病毒按1∶1 000 比例接種STHN細胞,37 ℃培養40 h,細胞病變達90%以上時收集,凍融3 次,合并后-20 ℃保存。 取小樣待檢。 將病毒液加10%血清,混勻,分裝于西林瓶中,于-80 ℃長期保存。 按同樣方法連續傳代至35 代,凍存各代次病毒并進行毒價測定。

1.2.2 TCID50測定

將收獲的各代次病毒毒液用細胞營養液DMEM 作10 倍系列稀釋,取稀釋度10-4—10-8接種長勢良好的STHN細胞(96 孔細胞培養板),每孔0.1 mL,設不接種病毒的正常細胞孔為對照。 37 ℃、5%CO2條件下培養5 d,觀察細胞病變,Reed-Muench 法計算TCID50。

1.2.3 無菌、支原體、外源病毒檢驗

按《中華人民共和國獸藥典》[13]附錄對收獲的各代次病毒液進行無菌檢驗。 按《中華人民共和國獸藥典》[13]附錄對抽提的1、5、10、15、20、25、30、35 代病毒液進行支原體及外源病毒檢驗。

1.2.4 PRVSX-gE 株的毒力試驗

用108.0TCID50∕mL 的PRVSX-gE F35 代病毒液對28 日齡的5 頭仔豬進行攻毒,每頭4 mL(肌注3 mL,滴鼻1 mL)。 對照組仔豬5 頭,不攻毒。 觀察14 d,記錄仔豬的臨床反應及體溫檢測。

1.2.5 PRVSX-gE 株免疫原性穩定性試驗

1.2.5.1 疫苗配制

將含量均大于108.33TCID50∕mL 的病毒與SDA28VG 佐劑以3∶1的比例配制疫苗備用。

1.2.5.2 對小鼠的免疫原性試驗

取40 只體重20 g 左右健康小鼠,隨機分成2 組,每組20 只,免疫組皮下注射F35 代PRVSX-gE 株滅活疫苗,0.3 mL∕只,免疫后14 d 后再次皮下注射0.3 mL∕只,另1 組不注射疫苗(對照組),二免14 d 后,兩組小鼠分別皮下注射強毒PRVBJ(108.0TCID50∕mL),劑量為0.2 mL∕只(含50 LD50),連續觀察10 d。 統計小鼠的臨床發病∕死亡情況。

1.2.5.3 對豬的免疫原性試驗

取15 頭28 日齡左右健康仔豬(PRV 抗原陰性和gB-ELISA 抗體陰性),隨機分為3 組,每組5 頭,第1 組分別肌肉注射F35 PRVSX-gE 滅活疫苗,2 mL∕頭;第2 組分別肌肉注射F35 PRVSX-gE 滅活疫苗,2 mL∕頭;第3 組為對照,不注射疫苗。 第1 組免疫后觀察14 d,觀察仔豬的臨床反應及體溫檢測。 第2 組分別于免疫后7 d、14 d、28 d 采血,分離血清,檢測PRVSX-gE 和gB 抗體;并于免疫后28 d 連同對照組滴鼻PRVBJ強毒株(105.0TCID50∕mL),1 mL∕頭,觀察仔豬的發病及死亡情況。

1.2.6 PRVSX-gE 株特異性試驗

用200 TCID50病毒液與等量PRVSX-gE 免疫后的血清中和1 h,取8 瓶細胞分2 組,每組4 瓶,一組接種中和液,另一組接種200 TCID50病毒液,每瓶1 mL,37 ℃吸附1 h 后每瓶加細胞維持液9 mL。 正常細胞為對照組,每瓶加細胞維持液10 mL。 置于37 ℃、5%CO2培養箱繼續培養,5—7 d 后觀察細胞的病變情況。

2 結果與分析

2.1 不同代次PRVSX-gE 株病毒含量檢驗

由表1 可知,不同代次之間病毒滴度無顯著差異,病毒含量均不低于108.33TCID50∕mL。

表1 PRVSX-gE 株不同代次病毒含量Table 1 Virus titer of different generations of PRVSX-gE strain TCID50·mL -1

2.2 不同代次PRVSX-gE 株無菌、支原體及外源病毒檢驗

由表2 可知,不同代次之間病毒液均無菌生長;且無支原體生長,無外源病毒污染。

表2 PRVSX-gE 株不同代次無菌、支原體、外源病毒檢驗Table 2 Sterility test,mycoplasma test and exogenous virus test results of PRVSX-gE strain

2.3 PRVSX-gE 株毒力檢驗

攻毒小組的仔豬體溫升高、食欲減退、消瘦,1 頭豬有腹瀉癥狀,7 d 后出現神經癥狀,5 頭豬全部發病。 對照豬無臨床癥狀。

2.4 免疫原性檢驗

2.4.1 對小鼠的免疫原性檢驗

由表3 可知,用PRVSX-gE 株病毒(108.33TCID50∕mL)配制的疫苗免疫小鼠后進行攻毒,對照組全部死亡,各代病毒制備的疫苗對小鼠保護率達90%以上。

表3 豬偽狂犬病滅活疫苗(PRVSX-gE 株)免疫小鼠的免疫原性檢驗Table 3 Immunogenicity test of pig pseudorabies inactivated vaccine(PRVSX-gE strain) in mice

2.4.2 對仔豬的免疫原性檢驗

用PRVSX-gE 株病毒(108.33TCID50∕mL)配制的疫苗免疫后,仔豬無體溫升高,也未出現應激反應等,說明疫苗安全性好。 接種PRVSX-gE 株病毒(108.33TCID50∕mL)配制的疫苗7 d 后仔豬抗體開始出現陽性,接種28 d 后抗體中和效價不低于1∶20,而對照組抗體為陰性。 接種后28 d,用PRV 強毒攻擊,免疫組未檢測到病毒,且無體溫升高、食欲減退、腹瀉及神經癥狀等;對照組均發病,其中2 頭死亡。 表明PRVSX-gE毒種具有良好的免疫原性,免疫豬能抵抗PRV 強毒攻擊(表4)。

表4 豬偽狂犬病滅活疫苗(PRVSX-gE 株)免疫仔豬的免疫原性檢驗Table 4 Immunogenicity test of pig pseudorabies inactivated vaccine(PRVSX-gE strain) in pigs

2.5 病毒特異性鑒定試驗

用200 TCID50病毒液與等量PRVSX-gE 免疫后的血清中和,中和后的液體接種STHN細胞,細胞未出現病變;而200 TCID50病毒液直接接種STHN細胞,則細胞出現圓縮特征性病變。

3 討論

PRVSX-gE 病毒液對仔豬進行攻毒后可致仔豬發病,說明本實驗室構建的PRVSX-gE 具有一定的毒力,可作為制備滅活疫苗的候選株。

將PRVSX-gE 株病毒在ST 細胞上連續傳至35 代,各代病毒培養物分別進行了毒價的測定及無菌檢驗,結果顯示,不同代次的毒價穩定并且無細菌和霉菌污染;第1、5、10、15、20、25、30、35 代病毒培養物支原體及外源病毒檢測顯示,各代次的種毒無支原體和外源病毒的污染。

小鼠免疫試驗中,免疫組對小鼠保護率均在90%及以上;在仔豬免疫試驗中,免疫組在豬免疫7 d后,產生抗體反應,免疫28 d 后用PRV 強毒攻擊,免疫組豬未檢測到病毒,也未出現PRV 感染豬的臨床癥狀,說明PRVSX-gE 株對豬和小鼠都具有良好的免疫原性。

豬偽狂犬病的流行對豬場造成的損失極大,疫苗免疫是防止該病流行的最有效措施。 PRVSX-gE 株毒種的分析可為PRVSX-gE 株的滅活疫苗研究奠定基礎。