筑巢能力障礙小鼠模型篩選及神經病理變化

肖福川 吳 娜 張 靜,3 陳柏安,3 盧 靜,3*

(1.首都醫科大學基礎醫學院實驗動物學學系，北京 100069；2.首都醫科大學基礎醫學院神經再生修復研究北京市重點實驗室，北京 100069; 3.首都醫科大學實驗動物部, 北京 100069)

認知障礙是危害老年人健康的主要疾病之一[1]，因其病程長、難逆轉、暫無有效治療方案，經常導致患者日常生活自理能力減退[2]，并伴有各種神經精神癥狀和障礙，給患者家庭和社會帶來極大負擔[3]。目前對散發性認知功能障礙的根本病因尚不明確[1]，對散發性認知障礙的治療方法也缺乏針對性。

筑巢行為實驗常用來評估認知障礙小鼠的日常活動[4]。該實驗在對小鼠施加最小壓力的同時，可以評估其精細動作的靈活性、認知和情緒狀態[5]。對小鼠來說，高質量的巢穴可以保溫、御敵，是一個保持安全感的重要場所[6]。小鼠的筑巢質量主要受遺傳背景、環境溫度、母性經驗以及是否有幼仔等因素影響[7-9]。此外，小鼠的筑巢行為可分為集體筑巢和個體筑巢，集體筑巢反映的是小鼠的社會交互行為[10]，而個體筑巢則反映了小鼠的執行功能。小鼠筑巢行為的機制目前尚不清楚，有研究者[11]推測其可能受到許多腦區和神經遞質活動的控制。

臨床上，認知障礙多是隨著年齡的增長自然發生的，而不是外加誘導劑或者手術等方式導致的，所以研究與人類自發性認知障礙更相似的動物模型及其神經病理特征能更好地為探究自發性認知障礙疾病的病因和防治提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠(000664-JAX)購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號:SCXK(京)2019-0008。本研究使用15月齡的C57BL/6小鼠39只，包括20只雌性和19只雄性，在首都醫科大學實驗動物部屏障環境[SYXK(京)2015-0012]飼養，經首都醫科大學實驗動物倫理委員會批準(批準號：AEEI-2015-020)。

1.1.2 主要試劑與儀器

筑巢所用的壓縮紙片是由中生北動(北京)科技發展有限公司定制，規格為7.5 cm×8 cm，3 g/片。突觸的標志物突觸后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95, PSD95;貨號：PA5-85749)抗體購自美國Thermo公司;神經元樹突的標志物微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2, MAP2; 貨號：ab8130)抗體、神經元軸突的標志物神經絲蛋白重鏈(neurofilament heavy chian,NFH；貨號：ab8135)抗體、神經元的標志物神經元核抗原(neuronal nuclei,NeuN; 貨號：ab104224)抗體、星形膠質細胞的標志物膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP;貨號：ab53554)抗體均購自英國Abcam公司;小膠質細胞的標志物離子鈣接頭蛋白1(ionized calcium bindingadaptor molecule 1, IBA1; 貨號：011-27991)抗體購自日本和光純藥工業株式會社; 抗熒光淬滅封片劑(貨號：P0126)、DAPI(貨號：C1002)購于上海碧云天生物技術有限公司；EDTA抗原修復液、PBS緩沖液購自北京基譜生物科技有限公司；無水乙醇、二甲苯購于中國醫藥集團有限公司；全自動脫水機(SYD-T2070)、石蠟包埋機(SYD-B-F)、病理取材臺(SYD-9804)、烘烤漂片機(SYD-PK)購自沈陽譽德電子儀器有限公司；石蠟切片機(Leica RM2016)購于德國萊卡公司；載玻片及蓋玻片(10127105P-G)購于江蘇世泰實驗器材有限公司；溫控搖床(TS-2000A)購于海門市其林貝爾儀器制造有限公司；倒置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-SR)購于日本尼康公司；全景掃描儀(Pannoramic MIDI)購于匈牙利3D HISTECH公司。

1.2 方法

1.2.1 筑巢

將實驗小鼠單獨飼養，移除所有的環境強化物品，在每個籠子里放一個3.0 g的方形壓縮棉片(Nestlets)。48 h后，用筑巢五分評級量表[4]評估筑巢情況，具體評分標準詳見表1。稱量所有未使用的Nestlets質量，精確到0.1 g(約Nestlets質量的4%)。

表1 筑巢實驗評分標準(方法)[4]

1.2.2 免疫熒光染色

將實驗組(15月齡野生型小鼠)中筑巢障礙的小鼠與筑巢表現良好的小鼠，進行麻醉、心臟灌注后取腦，使用4%(質量分數)多聚甲醛液將組織固定，脫水包埋后進行切片，厚度為4 μm。脫蠟、抗原修復后加5%(體積分數)的正常山羊封閉血清室溫孵育 20 min。棄去封閉血清后，加入一抗(稀釋比為1∶250)孵育過夜。滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋切片(兔二抗bs-0295G-FITC和羊二抗bs-0294D-cy3 稀釋比均為1∶400)，避光室溫孵育60 min。加入DAPI染液，避光室溫孵育10 min。用抗熒光淬滅封片劑封片。取景拍照。

1.2.3 分組方法

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 老齡小鼠筑巢能力障礙的模型篩選

根據筑巢結果，15月齡WT小鼠評分為2.52±0.41。本實驗中小鼠實際筑巢情況(圖1)證明了本研究所采用的筑巢5分法的可操作性。篩選出了7只(17.9%)發生筑巢障礙的小鼠，其中有1只小鼠在實驗過程中死亡，以及5只(12.8%)筑巢能力良好的小鼠。

圖1 筑巢實驗結果

2.2 筑巢能力障礙的老齡小鼠突觸表達水平

免疫熒光結果顯示，小鼠腦內PSD95標記的突觸呈綠色圓點狀，筑巢能力障礙組小鼠腦內顳葉區突觸的免疫熒光強度與筑巢能力良好組相比降低，差異有統計學意義(P<0.01)，而海馬組間區差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內PSD95表達

2.3 筑巢能力障礙的老齡小鼠神經元樹突表達水平

免疫熒光結果顯示，小鼠腦內MAP2標記的神經元樹突呈綠色長絲狀，筑巢能力障礙組小鼠腦內顳葉區神經元樹突的免疫熒光強度與筑巢能力良好組相比差異有統計學意義(P<0.05)，而海馬區組間差異無統計學意義(P>0.05)(圖3)。

圖3 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內MAP2表達

2.4 筑巢能力障礙的老齡小鼠神經元軸突表達水平

免疫熒光結果顯示，小鼠腦內NFH標記的神經元軸突呈綠色絲狀，筑巢能力障礙組小鼠腦內顳葉區和海馬區NFH的免疫熒光強度與筑巢能力良好組相比差異均無統計學意義(P>0.05)(圖4)。

圖4 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內NFH表達

2.5 筑巢能力障礙的老齡小鼠神經元數量

免疫熒光結果顯示，小鼠腦內神經元標記物NeuN主要表達在細胞核上呈紅色圓形，筑巢能力障礙組小鼠腦內顳葉區和海馬區神經元(NeuN)的陽性細胞個數與筑巢能力良好組相比差異均無統計學意義(P>0.05)(圖5)。

圖5 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內NeuN表達

2.6 筑巢能力障礙的老齡小鼠小膠質細胞數量

免疫熒光結果顯示，小鼠腦內小膠質細胞標記物IBA1主要表達在細胞膜上，筑巢能力障礙組小鼠腦內顳葉區和海馬區IBA1的陽性細胞個數與筑巢能力良好組相比差異均無統計學意義(P>0.05)(圖6)。

圖6 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內IBA1表達

2.7 筑巢能力障礙的老齡小鼠星形膠質細胞數量

免疫熒光結果顯示，小鼠腦內星形膠質細胞標記物GFAP主要表達在細胞膜上，發生筑巢能力障礙組小鼠腦內顳葉區和海馬區星形膠質細胞的陽性細胞個數與筑巢能力良好組相比差異均無統計學意義(P>0.05)(圖7)。

圖7 筑巢功能障礙組和良好組小鼠腦內GFAP表達

3 討論

隨著人們生活質量的提高，人口老齡化的現象越來越嚴重，年齡相關性疾病，尤其是認知功能障礙極大地影響了人們的生活質量，引起了人們的關注[12-13]。但是，自發性認知障礙的原因目前尚不清楚，老年群體中出現散發性的認知障礙個體的機制也有待研究。認知包括記憶、語言、視空間、執行、計算和理解判斷等多方面，個體筑巢實驗可用于評估小鼠日常活動的執行能力[14]。本研究通過個體筑巢實驗篩選出了自然發生筑巢障礙的老齡小鼠，并通過免疫熒光染色分析了自然發生筑巢障礙小鼠腦內認知相關的神經病理學變化特征。

小鼠的遺傳背景、生長及飼養環境、筑巢材料及實驗方法等因素均可影響個體筑巢實驗結果[11]。本研究選用了遺傳背景相近的15月齡近交系野生型小鼠作為實驗對象，在相同的實驗條件下，實驗組小鼠表現出了筑巢能力的差異。為了探索這一現象的原因，以實驗組為標準，從實驗組中篩選出了7只自然發生筑巢障礙的小鼠(17.9%)，以及5只筑巢表現良好的小鼠(12.8%),該發病率與國內臨床上認知功能障礙的流行病學調查結果(20.8%)[15]相近。這個結果提示，通過筑巢實驗篩選出自然發生筑巢障礙的小鼠模型可用于研究自發性認知功能障礙。

PSD位于神經元興奮性突觸后膜，參與突觸后信號轉導和整合，可調節突觸谷氨酸受體的定位[16]。PSD95是指相對分子質量為95 000的突觸后致密蛋白，是PSD的主要成分[17]。PSD95本身無蛋白酶活性，主要是通過不同結構域與相關受體及信號分子結合，形成信號復合物發揮作用，具有參與突觸連接的形成、維持突觸的可塑性等多種生物學功能，與神經退行性疾病的發生、發展有關[18]。本研究通過免疫熒光分析發現自然發生筑巢障礙的老齡小鼠顳葉區的突觸的免疫熒光強度較筑巢良好組減少，差異有統計學意義(P<0.01)，而海馬區突觸差異無統計學意義。氧化應激、離子型谷氨酸受體介導的興奮性毒性作用及線粒體功能障礙等均可能導致顳葉區突觸可塑性降低[19]，但具體原因目前尚未闡明，還需深入探究。

神經元樹突和軸突復雜的形狀決定了細胞可以建立的突觸連接，具有重要作用。它與細胞分子成分選擇性地分布到軸突或樹突的特定區域有著千絲萬縷的聯系[20]。微管是神經元樹突中的主要骨架蛋白，參與維持細胞形態及物質運輸等過程[21]。MAP2是一種定位于神經元樹突的微管相關蛋白[22]。本研究通過免疫熒光分析發現自然發生筑巢障礙的老齡小鼠顳葉區的神經元樹突的免疫熒光強度較筑巢良好組減少，差異有統計學意義(P<0.05)，推測其可能出現的原因是DNA損傷的異常修復或能量代謝障礙[23]，有待進一步的研究。而海馬區神經元樹突呈現減少趨勢，但是差異無統計學意義。這個結果提示，筑巢反映的認知障礙可能與顳葉所負責的情感活動有關，而不是海馬區負責的短期學習記憶。

NFH是軸突的主要成分之一，是神經元軸突的標志物[24]。NeuN是一種神經元核抗原，可識別神經元的胞體，通常用作神經元的標記[25]。IBA1為小膠質細胞的標志物，是一種離子鈣結合銜接分子。在機體受到損傷或者感染時，正常情況下處于靜息狀態的小膠質細胞被激活活化為具有免疫功能的細胞，此時，IBA1會上調[26]。GFAP是一種膠質纖維酸性蛋白，是活化的星形膠質細胞的標志物，參與細胞骨架的構成并維持其張力強度[27]。在本研究中，自然發生筑巢障礙的15月齡C57BL/6小鼠腦內顳葉區和海馬區的神經元軸突的免疫熒光強度、神經元、小膠質細胞以及星形膠質細胞的陽性細胞個數均差異無統計學意義(P>0.05)。可初步認為，筑巢實驗篩選出的筑巢障礙模型，未發生神經元軸突的損傷以及神經元的凋亡，并且自發性筑巢障礙的原因可能不是小膠質細胞和星形膠質細胞異常所引起的神經炎癥反應。

綜上所述，通過筑巢實驗可以篩選出老齡小鼠自然發生筑巢障礙的模型，該篩選方法簡單易學，實驗周期短，不會引起實驗動物應激，具有良好的可操作性和重復性。本研究中筑巢障礙組老齡小鼠顳葉區突觸和神經元樹突的顯著減少提示突觸可塑性的降低可能是導致發生自發性筑巢障礙的原因，但具體的機制還需進一步的研究。