發酵工藝對白啤4-VG 含量的影響分析

張健唯，梁 宸，劉助水

（1.北京燕京啤酒股份有限公司，北京 100083；2.燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司，廣西桂林 541002）

啤酒的風味質量包括啤酒的風味強度、風味組成和風味穩定性三個主要方面，啤酒的口感一致性和風味穩定性對消費者的影響比較直接、重要，受到啤酒行業的廣泛關注，提高啤酒的口感一致性和風味穩定性也是啤酒行業面臨的重要挑戰。

酚類是構成啤酒活性風味物質的重要組成之一，已經檢測出的有揮發性酚、愈創木酚、苯酚等，其中4-乙烯基愈創木酚（4-vinylguaiacol,4-VG）是小麥啤酒的特征性香氣物質，具有揮發性，有獨特發酵香氣，嗅覺識別度較高，能夠給小麥啤酒帶來特殊香味。4-VG 并非天然存在于啤酒原料中，而是在生產啤酒的制麥、糖化和發酵各個環節中由阿魏酸發生脫羧反應。4-VG 的產生途徑有兩種：（1）前體物質阿魏酸經過高溫熱脫羧反應生成4-VG；（2）阿魏酸經過酶催化脫羧反應生成4-VG。

白啤是小麥啤酒的一種，關于糖化工藝參數對白啤4-VG 含量影響的研究較多，但關于發酵工藝參數對白啤4-VG 含量影響的研究不是非常完全。因此，本研究系統研究酵母菌種、酵母代數、酵母接種量、發酵溫度、冷麥汁充氧量5 種發酵工藝參數對白啤4-VG 含量的影響，以期通過優化發酵工藝參數提高白啤中4-VG的含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料和菌株：大麥芽（麥特卡夫），粵海永順泰（廣州）麥芽有限公司；小麥芽，歐麥(保定)麥芽有限公司；酵母菌株，燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司保藏。

試劑及耗材：乙腈（色譜純），美國Fisher 公司；三氟乙酸（純度99.5%），阿拉丁試劑（上海）有限公司；4-VG（純度98%），德國Sigama公司。

儀器設備：液相色譜儀（規格型號：1200系列），安捷倫科技（中國）有限公司；紫外檢測器，安捷倫科技（中國）有限公司；電子天平（精度0.0001 g），梅特勒-托利多集團；超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司精釀啤酒生產線（糖化麥汁單鍋產量2 t，發酵一鍋麥汁進罐），寧波樂惠國際工程裝備股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥汁制備

原料配比為60%大麥芽+40%小麥芽，麥芽采用干法粉碎，下料溫度38 ℃（保溫時間10 min），蛋白質休止溫度45 ℃（保溫時間10 min），糖化溫度63 ℃（保溫時間30 min），糖化溫度72 ℃（保溫時間25 min），醪液升溫到76 ℃后送入過濾槽，煮沸90 min（蒸發率控制8%），回旋沉淀30 min，麥汁冷卻35 min（冷麥汁溫度與發酵溫度相同），充氧后進入立式發酵罐進行發酵。冷麥汁理化指標控制：原麥汁濃度12°P±0.3°P，氨基氮250 mg/L±20 mg/L，總酸1.6 mL/100 mL±0.1 mL/100 mL，pH5.6±0.1，色度10 EBC±1 EBC。

1.2.2 發酵工藝

根據實驗需要，調整5 種發酵工藝參數。一是接種的酵母菌株，分別采用公司保藏的4 款上面酵母，編號為No.1、No.2、No.3、No.4，0 代酵母經實驗室純培，再用20 L卡式罐下種至精釀啤酒生產線進行擴培，最后根據發酵工藝的酵母接種量，將擴培液送入發酵罐，再將冷麥汁送入發酵罐；二是酵母代數，分別為0 代、1 代、2 代、3 代，除0 代酵母之外，其余代數的酵母通過酵母在線添加管道，在冷麥汁進罐0.1 t 且冷麥汁溫度穩定后定量添加；三是酵母接種量，分別為4 百萬個/mL、6 百萬個/mL、8 百萬個/mL、10 百萬個/mL，除0 代酵母之外，其余代數的酵母通過使用ABER 活性酵母計數儀進行定量添加，從而達到試驗酵母接種量的要求；四是發酵溫度，分別為14 ℃、16 ℃、18 ℃、20 ℃；五是冷麥汁充氧量，分別為18 mg/L、20 mg/L、22 mg/L、24 mg/L（mg/L表示每升冷麥汁充入氧氣的質量），充氧后段使用蛇形管，以提高冷麥汁充氧的效果。

1.2.3 4-VG含量的測定

從發酵液滿罐后第1 天起，每天上午定時取樣，測量發酵液4-VG 含量。檢測方法參考T/CBJ 3103—2020白啤酒團體標準中高效液相色譜法（第一法）進行測定。檢測步驟大致如下：先制定標準溶液/校正曲線、控制樣，再將樣品經振蕩脫氣，先后經過單層中速濾紙、0.22 μm過濾頭過濾，直接進樣，最后進行結果計算，結果取小數點后一位。

2 結果與分析

2.1 酵母菌種對白啤4-VG含量的影響

試驗將酵母菌株設置為變量，其余發酵工藝參數為：酵母代數0 代、酵母接種量6百萬個/mL、發酵溫度18 ℃和冷麥汁充氧量20 mg/L。酵母是啤酒的靈魂，它對啤酒風味起著決定性作用，接種不同酵母釀造出的啤酒風味各異，選擇適宜的上面發酵酵母是產生白啤特色丁香香氣的關鍵因素。

如圖1 所示，4 種不同酵母釀造的白啤中4-VG含量差異明顯。上面發酵酵母的POF（phenolic off-flavour）基因編碼的阿魏酸脫羧酶能夠催化4-VG 的前體物質阿魏酸脫羧生成4-VG，從而賦予白啤酚香味。上面發酵酵母中含有POF 基因，賦予小麥啤酒酚香味，根據酚香味的差異將上面發酵酵母分為POF+型和POF-型，POF+酵母比POF-酵母產生的酚香和丁香香氣更加濃郁。能夠釀造啤酒產生4-VG 含量高于2.5 mg/L 的酵母為POF+酵母，低于此含量的為POF-酵母。

圖1 酵母菌種與4-VG含量的關系

試驗的4 種上面酵母中，No.3 和No.4 發酵產生的4-VG 含量較高，No.2 發酵產生的4-VG 含量適中，No.1 發酵產生的4-VG 含量較少。此結果證明上面酵母No.3和No.4為POF+菌，上面酵母No.1和No.2為POF-菌。

在選擇酵母的同時需要考慮其對白啤“酸感”帶來的影響，口感過酸往往會降低消費者的體驗感。乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸是白啤釀造過程中帶來“酸感”的主要物質，不同酵母對以上4 種酸的代謝能力差別較大。本研究的檢測和品評結果顯示，上面酵母No.3 和No.4 釀造的白啤在產生4-VG含量合適的情況下，“酸感”表現良好。

2.2 酵母代數對白啤4-VG含量的影響

試驗將酵母代數設置為變量，其余發酵工藝參數為：酵母No.3、酵母接種量6 百萬個/mL、發酵溫度18 ℃和冷麥汁充氧量20 mg/L。

如圖2 所示，用0 代到3 代酵母釀造的白啤中4-VG 含量呈逐漸下降趨勢，這與上面酵母中苯丙烯酸活性脫羧酶PADl(POFl)的作用效果有關。本試驗使用立式發酵罐，采用一罐法進行釀造，只有在對發酵罐降溫后，才能從發酵罐錐底得到足夠多的上面酵母，從而進行傳代投料試驗，此時酵母已長時間處于缺乏營養狀態，且初期沉降下來的酵母，其自身活力及脫羧酶活性相對較弱。隨著酵母代數增多，白啤4-VG 含量會逐漸下降。根據本公司的研發生產經驗，要想保持口感和風味的穩定性，對于大部分酵母來說，一般將代數控制在3 代以內為佳。這一論斷也并不是絕對的，與酵母菌株的特性有關，有些酵母控制在第5 代也不會對生產造成明顯的不良影響。

圖2 酵母代數與4-VG含量的關系

2.3 酵母接種量對白啤4-VG含量的影響

試驗將酵母接種量設置為變量，其余發酵工藝參數為：酵母No.3、酵母代數0 代、發酵溫度18 ℃和冷麥汁充氧量20 mg/L。

如圖3 所示，白啤中4-VG 的含量隨著酵母接種量的增加而上升，當酵母添加量大于6 百萬個/mL時，4-VG 的含量高于5 mg/L。接種量的多少直接影響發酵周期長短、酵母的生長繁殖速度、酵母峰值和風味代謝物質的含量。適宜的接種量可為酵母創造種群優勢，排除雜菌的影響。接種量通過影響酵母的增殖數量和發酵速度，間接對白啤中4-VG等酚類物質產生影響。

圖3 酵母接種量與4-VG 含量的關系

上面酵母的酵母接種量不建議太高，一般控制在15 百萬個/mL 以內為佳。過高的酵母接種量，一方面會造成發酵液前期降糖速度偏快，出現溢泡現象，容易染菌；另一方面，酵母在高溫下大量繁殖會導致酒液的雜醇和總酸含量增加，進而嚴重影響啤酒的口感協調性和可飲性，消費者會出現飲后“上頭”的現象。

2.4 發酵溫度對白啤4-VG含量的影響

試驗將發酵溫度設置為變量，其余發酵工藝參數為：酵母No.3、酵母代數0代、酵母接種量10百萬個/mL 和冷麥汁充氧量20 mg/L。上面發酵酵母發酵溫度通常高于下面發酵酵母，一般控制在15～25 ℃。發酵溫度通過影響酵母新陳代謝的速度進而影響發酵所產生的風味物質含量。發酵過程中酶催化脫羧反應生成4-VG，合理控制發酵溫度有利于酵母處于最佳生長繁殖狀態及阿魏酸脫羧酶在最適反應條件下發揮催化作用，進而提高最終白啤中的4-VG 含量。一般情況下，發酵溫度不同，白啤中4-VG 含量存在一定的差異，4-VG含量隨發酵溫度的升高而上升。

如圖4 所示，當溫度設置為16 ℃時，4-VG 含量上升速率較慢，且最終含量較低，說明此溫度未能使酶充分發揮活性達到轉化阿魏酸的目的；在18～20 ℃，4-VG 含量上升較快，說明溫度在此區間內越來越接近酶的最適反應溫度，酶的活性逐漸提高。考慮到啤酒生產中的能耗和發酵過程中會生成其他風味物質，酵母在代謝氨基酸和糖的過程中同時會產生雜醇，發酵溫度過高會使啤酒中的雜醇含量過高、總酸偏高、苦味值低、泡沫性能差且容易染菌，對成品酒風味造成不良影響。當發酵溫度超過20 ℃時，4-VG 含量的增幅小于醇類的增幅，醇類增幅相對較多，飲后易出現“上頭”現象。

圖4 發酵溫度與4-VG含量的關系

2.5 冷麥汁充氧量對白啤4-VG含量的影響

試驗將冷麥汁充氧量設置為變量，其余發酵工藝參數為：酵母No.3、酵母代數0 代、酵母接種量10百萬個/mL和發酵溫度20 ℃。

如圖5 所示，白啤中4-VG 的含量隨著冷麥汁充氧量的增加而上升，且在18～22 mg/L 范圍內4-VG 含量上升較快。提高冷麥汁充氧量會提高酵母數的峰值，發酵罐內的酵母峰值越高，阿魏酸經過酶催化脫羧反應生成的4-VG 就會越多。當冷麥汁充氧量超過22 mg/L 時，4-VG 含量變化趨勢逐漸平穩，此時冷麥汁的溶氧量已基本達到飽和狀態，即使再提高冷麥汁充氧量，過飽和部分的氧在麥汁進罐過程中也會很快形成氣泡逸出發酵罐，不能被酵母所利用，酵母數的峰值不會有明顯提高，4-VG含量就不會再增加。

圖5 冷麥汁充氧量與4-VG 含量的關系

值得注意的是，增加冷麥汁充氧量會提高酵母數的峰值，啤酒中雜醇和總酸的含量也會增加，總酯含量減少；充氧量過低不利于酵母增殖，會使乙醛含量上升、發酵周期延長。所以在設計冷麥汁充氧量時，不能單方面的考慮4-VG 含量，也需兼顧白啤其他指標。

3 結論

近年來，我國啤酒行業開始從擴大規模向提高檔次的發展方向轉變，各啤酒品牌相繼推出白啤產品來布局高端市場。白啤具有特殊的丁香香氣，酒體渾濁且泡沫豐富，口感飽滿且苦味值較低。本文通過單因素試驗研究了酵母菌種、酵母代數、酵母接種量、發酵溫度和冷麥汁充氧量這5 種發酵工藝參數對白啤4-VG 含量的影響，其中酵母菌種的影響最大。對于白啤的釀造，應該提高4-VG 含量而突出其丁香的香氣特征，但不能單一考慮此因素而影響乙醛、雜醇、總酸和總酯等指標的含量，對產品風味和口感造成損失，應該兼顧白啤風味的平衡性和穩定性、口感的一致性和可飲性。基于以上考量并經過多次試驗驗證，得到提高白啤中4-VG 含量的最佳發酵工藝參數為:以燕京漓泉公司保藏的No.3酵母為發酵酵母、酵母代數0代、酵母接種量10百萬個/mL、發酵溫度20 ℃、冷麥汁充氧量22 mg/L。在最佳發酵工藝條件下釀造出的白啤產品丁香香氣特征突出，無其他異雜味，口感豐富、一致性和可飲性良好，酒體平衡、穩定、協調。本研究為釀造白啤工藝提供了參考依據。