丹紅注射液治療大鼠肺動脈高壓的作用及機制研究

余松平　詹宇亮　涂偉玲　孫漢俊　李彬

【摘要】 目的：探討丹紅注射液治療肺動脈高壓（pulmonary hypertension， PH）的分子生物學機制。方法：選擇雄性SD大鼠36只，采用隨機數字表法分為Normal組、MCT組、MCT+BT組、MCT+BT+DHI組，每組9只。采用腹腔注射野百合堿法復制PH大鼠模型，采用右心導管法測定大鼠平均肺動脈壓，采用免疫組織化學方法測定肺組織中血管內皮生長因子A（VEGFA）的表達，HE染色觀測肺動脈平滑肌細胞組織病理學變化，運用蛋白免疫印跡（Western blot）方法檢測肺組織中細胞內磷酸化絲/蘇氨酸激酶（Akt）、內皮細胞一氧化氮合酶（eNOS）蛋白的表達。結果：與Normal組比較，MCT組大鼠的mPAP明顯上升（P<0.05）;與MCT組比較，MCT+BT組、MCT+BT+DHI組大鼠的mPAP均明顯下降（P<0.05）;MCT+BT組與MCT+BT+DHI組大鼠的mPAP比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與Normal組的WT比較，MCT組的WT明顯上升（P<0.05）;與MCT組比較，MCT+BT組、MCT+BT+DHI組的WT均明顯下降（P<0.05）;與MCT+BT組比較，MCT+BT+DHI組的WT明顯下降（P<0.05）。與Normal組的VEGFA平均光密度值比較，MCT組的VEGFA 平均光密度值明顯上升（P<0.05）;與MCT組比較，MCT+BT組、MCT+BT+DHI組的VEGFA平均光密度值均明顯上升（P<0.05）;與MCT+BT組比較，MCT+BT+DHI組VEGFA蛋白平均光密度值明顯上升（P<0.05）。與Normal組比較，MCT組Akt、eNOS蛋白的相對表達量均明顯下降（P<0.05）;與MCT組比較，MCT+BT組、MCT+BT+DHI組的Akt、eNOS蛋白的相對表達量均明顯上升（P<0.05）;與MCT+BT組比較，MCT+BT+DHI組的Akt、eNOS蛋白的相對表達量均明顯上升（P<0.05）。結論：丹紅注射液不僅能夠改善PH模型大鼠肺動脈平滑肌細胞病理形態學變化，促進血清VEGFA的生成和釋放，并且能夠調節Akt、eNOS蛋白的表達，從而抑制肺血管重塑，調節肺動脈舒張功能。

【關鍵詞】 肺動脈高壓 丹紅注射液 VEGFA PI3K/Akt/eNOS信號通路

Effect and Mechanism of Danhong Injection on Pulmonary Hypertension in Rats/YU Songping， ZHAN Yuliang， TU Weiling， SUN Hanjun， LI Bin. //Medical Innovation of China， 2022， 19（14）： 0-015

[Abstract] Objective： To explore the molecular biological mechanism of Danhong Injection in the treatment of pulmonary hypertension （PH）. Method： A total of 36 male SD rats were randomly divided into Normal group， MCT group， MCT + BT group and MCT + BT + DHI group， with 9 rats in each group. The PH rat model was established by intraperitoneal injection of monocrotaline. The mean pulmonary artery pressure was measured by right cardiac catheterization. The expression of VEGFA in lung tissue was measured by immunohistochemical method. The histopathological changes of pulmonary artery smooth muscle cells were observed by HE staining. The expression of Akt and eNOS protein in lung tissue was detected by Western blot. Result： Compared with Normal group， mPAP in MCT group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT group， mPAP in MCT + BT group and MCT + BT + DHI group decreased significantly （P<0.05）; there was no significant difference in mPAP between MCT + BT group and MCT + BT + DHI group （P>0.05）. Compared with WT in Normal group， WT in MCT group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT group， WT in MCT + BT group and MCT + BT + DHI group decreased significantly （P<0.05）; compared with MCT + BT group， WT in MCT + BT + DHI group decreased significantly （P<0.05）. Compared with the average optical density of VEGFA of Normal group， the average optical density of VEGFA of MCT group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT group， the average optical density of VEGFA in MCT + BT group and MCT + BT + DHI group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT + BT group， the average optical density of VEGFA protein in MCT + BT + DHI group increased significantly （P<0.05）. Compared with Normal group， the relative expression of Akt and eNOS protein in MCT group decreased significantly （P<0.05）; compared with MCT group， the relative expression of Akt and eNOS protein in MCT + BT group and MCT + BT + DHI group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT + BT group， the relative expression of Akt and eNOS protein in MCT + BT + DHI group increased significantly （P<0.05）. Conclusion： Danhong Injection can not only improve the pathological changes of pulmonary artery smooth muscle cells in PH model rats， promote the production and release of serum VEGFA， but also regulate the expressions of Akt and eNOS proteins， thereby inhibiting pulmonary vascular remodeling and regulating pulmonary artery diastolic function.

[Key words] Pulmonary hypertension Danhong Injection VEGFA PI3K/Akt/eNOS signaling pathway

First-author’s address： Jiangxi Provincial People’s Hospital， Nanchang 330006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.14.003

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是以肺血管阻力進行性增高為主要特征的一種臨床綜合征，主要由于通過肺循環的血流受阻，導致肺動脈壓力病理性升高，可造成右心衰竭[1]。PH患者的診斷標準為，以海平面大氣壓為參照，在靜息狀態下，經右心插入導管測得平均肺動脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥25 mmHg[2]。根據流行病學調查顯示，超過85%的PH患者由左心疾病、肺部疾病和/或缺氧引起[3]。目前應用于臨床的抗PH藥物有波生坦（Bosentan，BT）、依前列醇（Epoprostenol，EP）等，雖然能夠調節肺動脈收縮功能，但對于靶向肺動脈重構過程仍有待進一步研究[4]。研究發現，丹紅注射液（Danhong Injection，DHI）可以通過多途徑作用于血管內皮，促進血管的生成和修復[5]。為進一步探究DHI對肺動脈血管內皮的靶向作用，本研究擬觀察DHI對PH大鼠模型肺動脈平滑肌細胞病理形態學及血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），細胞內磷酸化絲/蘇氨酸激酶（Akt），內皮細胞一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表達的影響，探究DHI治療PH的可能作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。雄性清潔級SD大鼠36只，平均（2.03±0.26）月齡，體重（220±20）g，由南昌大學醫學部實驗動物中心提供[許可證號：SYXK（贛）2015-0001]。按照國家科委頒布的《實驗動物管理條例》進行適應性飼養1周。（2）藥物和試劑。波生坦片（生產廠家：加拿大Patheon Inc，批準文號：注冊證號H20170013，規格：

125 mg/片）;丹紅注射液（生產廠家：山東丹紅制藥有限公司，批準文號：國藥準字Z20026866，規格：10 mL/支）;98%野百合堿（美國 Sigma），蘇木素-伊紅（HE）染液（美國Solarbio）;大鼠VEGFA單克隆抗體（英國Abcam）;抗Akt、eNOS抗體（美國Cell signaling）。（3）儀器。YP-200型壓力換能器（北京新航興業科貿有限公司）;MedlabU/4C生物信號釆集處理器（南京美易科技有限公司）;BX51光學顯微鏡（日本 Olympus 電子公司）;LEICACM-1950冰凍切片機（德國徠卡公司）;H3-18K臺式高速離心機離心力（德國Sigma 公司）;Western-blot儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 選擇雄性SD大鼠36只，采用隨機數字表法分為Normal組、MCT組、MCT+BT組、MCT+BT+DHI組，每組9只。MCT給藥劑量（MCT組、MCT+BT組、MCT+BT+DHI組）按1 mL/200 g

比例一次性腹腔注射2%中鏈甘油三酯（MCT），Normal組按1 mL/200 g比例一次性腹腔注射0.9%氯化鈉注射液。常規飼養4周后，禁食、水24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，備皮充分暴露右側頸部皮膚，常規消毒后進行右側頸靜脈穿刺，穿刺成功后將注入適量肝素的導管沿頸外靜脈插入右心房，連接YP-200型壓力換能器，接入MedlabU/4C生物信號釆集處理器，觀察計算機反饋的圖像和波形，確認導管經右心室進入肺動脈，待波形穩定后，記錄大鼠mPAP數值，以波形穩定狀態下mPAP≥25 mmHg為造模成功。

1.2.2 分組及給藥 MCT+BT組同時注射MCT?1 mL/200 g與BT 50 mg/（kg·d）、MCT+BT+DHI組同時注射MCT 1 mL/200 g、BT 50 mg/（kg·d）、DHI 50 mg/（kg·d），其他組（Normal組和MCT組）按同等劑量予以0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，連續干預2周。

1.2.3 標本采集及測定 （1）干預結束后，禁食、水24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，右側頸靜脈穿刺后經右心房向肺動脈送入導管，測得大鼠mPAP數值。放血法處死大鼠，迅速取出肺組織并分離肺動脈，用生理鹽水沖凈后再經梯度酒精脫水，留取部分肺組織-80 ℃冰箱凍存，另外一部分肺組織和肺動脈用4%多聚甲醛固定后，依次進行透明、浸蠟、包埋和制片。選擇較粗的肺動脈主干部位的切片進行HE染色，光學顯微鏡下觀察大鼠肺動脈平滑肌細胞組織病理學變化，并將肺動脈管壁厚度與血管外徑的橫截面拍攝并轉換為數字圖像，計算管壁厚度與血管外徑比值WT。（2）選取合適的肺組織切片，依次進行脫蠟、修復、冷卻、沖洗和稀釋后，先加入5%正常山羊血清，室溫封閉條件下孵育30 min，然后進行一抗孵育，去掉血清，滴加1︰1 000 VEGFA單克隆抗體，室溫4 ℃過夜再進行二抗孵育，1 h后在光學顯微鏡下采集圖像，光鏡下血管周圍顯現棕黃色的顆粒物，則為陽性反應。將采集的圖像導入Image-Pro Plus軟件中檢測平均光密度值（IOD/Area），以IOD/Area的大小表示VEGFA表達的水平。（3）稱取200 mg冰凍的肺組織，加入1 mL裂解液在4 ℃下充分勻漿，30 min后轉移充分裂解后的勻漿液至離心管中，在室溫4 ℃，以12 000 r/min離心10 min后得到上層清液，并測定蛋白含量。再以每孔20 μL進行上樣，經電泳2 h后轉至PVDF膜上進行常規抗體孵育，待二抗孵育完成1 h后，于暗室中加入曝光液，充分曝光30 min后獲得底片顯影圖像，利用Adobe Photoshop CC軟件對掃描底片顯影圖像所得的條帶進行灰度值分析，以β-actin蛋白條帶積分光密度值為參照，目標蛋白的相對表達量P=目標蛋白條帶積分光密度值/β-actin蛋白條帶積分光密度值。

1.3 統計學處理 利用SPSS 24.0對所有數據進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠mPAP比較 與Normal組的mPAP（9.21±6.79）mmHg比較，MCT組的（31.28±10.37）mmHg明顯上升（P<0.05）;與MCT組的mPAP比較，MCT+BT組的（23.43±8.58）mmHg、MCT+BT+DHI組的（20.69±9.38）mmHg均明顯下降（P<0.05）;MCT+BT組與MCT+BT+DHI組大鼠的mPAP比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.2 大鼠肺動脈平滑肌細胞病理變化 大鼠肺動脈血管典型病理變化見圖2。與Normal組的WT（17.43±4.93）%比較，MCT組的（38.24±7.52）%明顯上升（P<0.05）;與MCT組的WT比較，MCT+BT組的（25.33±5.14）%、MCT+BT+DHI組的（18.73±4.32）%均明顯下降（P<0.05）;與MCT+BT組比較，MCT+BT+DHI組的WT明顯下降（P<0.05）。見圖3。

2.3 對大鼠肺組織VEGFA蛋白平均光密度值的影響 免疫組化法檢測結果顯示，與Normal組的VEGFA蛋白平均光密度值（0.86±0.06）比較，MCT組的（1.33±0.01）明顯上升（P<0.05）;與MCT組的VEGFA蛋白平均光密度值比較，MCT+BT組的（1.42±0.05）、MCT+BT+DHI組的（1.77±0.02）均明顯上升（P<0.05）;與MCT+BT組比較，MCT+BT+DHI組VEGFA蛋白平均光密度值明顯上升（P<0.05）。見圖4。

2.4 對大鼠Akt、eNOS蛋白表達的影響 P-Akt、P-eNOS蛋白的相對表達量分別為（0.96±0.04）、（0.98±0.05），與Normal組比較，MCT組（0.63±0.03）、（0.62±0.06）均明顯下降（P<0.05）;與MCT組的P-Akt、P-eNOS蛋白的相對表達量比較，MCT+BT組（0.75±0.05）、（0.72±0.05），MCT+BT+DHI組（0.97±0.06）、（0.99±0.06）均明顯上升（P<0.05）;與MCT+BT組比較，MCT+BT+DHI組的Akt、eNOS蛋白的相對表達量均明顯上升（P<0.05）。見圖5、6。

3 討論

根據最新流行病學調查顯示，占全球1%的人口深受PH的困擾，尤其是在65歲以上人群中患病率高達5%～10%[6]，且PH預后極差，被稱為“心血管系統的惡性腫瘤”。關于引起PH的病因較為復雜，約有40種疾病的發生發展與PH相關，并且根據其臨床特征大致可分為五類，分別為與動脈相關的PH、由左心疾病導致的PH、由肺部疾病和/或低氧導致的PH、由慢性血栓栓塞導致的PH以及不明因素或多因素綜合作用導致的PH[1，7]。目前關于PH的發生發展，大多數研究認為與肺動脈血管重構有關，而引起肺動脈血管重構的主要病理改變為肺動脈平滑肌細胞異常增殖和肥大。研究表明，肺動脈平滑肌細胞的增殖機制受多種生長因子受體水平改變及相關信號通路調節的影響[8-11]。

VEGFA是公認的促進血管生成的重要因子，參與并調節了胚胎的發育及血管的生成過程[12]。體外研究發現，VEGF的增加可減少人肺微血管內皮細胞產生內皮素-1（endothelin-1，ET-1）表達，從而抑制肺血管重塑[13]。PI3K是一種磷脂酰肌醇酶，Akt是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，eNOS是一種一氧化氮合酶，近年來研究發現，PI3K可通過激活下游的Akt調控eNOS的活性，而血管內皮細胞內的被激活的eNOS作用于L-精氨酸，在分子氧的參與下可合成具有調節肺血管的內皮源性血管舒張因子一氧化氮（nitric oxide，NO）[14]。

目前應用于臨床的抗PH藥物波生坦通過拮抗內皮素受體A/B（endothelial receptor A/B，ETR-A/B），阻止ET-1與肺動脈平滑肌細胞ETR-A/B結合，使ET-1無法產生強烈的收縮血管作用，進而改善患者血流動力學參數[15]。盡管波生坦在抗PH的作用上療效確切，但有研究表明，聯合波生坦的多靶向治療較單藥治療更能改善患者預后[16]。現代藥理學研究表明，DHI可以調節多個疾病相關的途徑，實現促血管新生、改善血管內皮功能、改善血管血流、保護血管內皮等過程[17]。DHI含有五種活性成分，分別為丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和羥基紅花黃色素A，研究發現，這五種活性成分均可促進內皮細胞增殖，促進VEGAF的表達，并且丹參素和羥基紅花黃色素A促進新生血管活性較顯著[18]。還有研究發現，DHI可通過激活心肌細胞PI3K/Akt信號通路，抑制心肌缺血-再灌注過程中心肌細胞的凋亡[19]。但目前關于DHI激活肺組織PI3K/Akt信號通路發揮肺動脈血管內皮細胞保護效應的報道較少。

本研究通過復制大鼠PH模型，應用BT和DHI干預2周后，大鼠肺動脈平滑肌細胞病理變化改善明顯;檢測VEGFA的含量及PI3K、Akt、eNOS蛋白的表達，結果顯示BT+DHI能夠促進血清VEGFA的生成和釋放，抑制肺血管重塑，調節肺動脈舒張功能，抑制肺血管內皮細胞凋亡，進而改善肺動脈平滑肌細胞病理變化。另外，本次實驗僅觀測了BT+DHI調節肺動脈血管內皮個別因子，雖然反映了BT與DHI聯合的多靶向調節作用，但有關BT與DHI聯合應用是否會增加單獨應用BT不良反應的發生率仍有待進一步研究。

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（收稿日期：2021-10-18） （本文編輯：占匯娟）