基于網(wǎng)絡藥理學探討大黃治療潰瘍性結(jié)腸炎的機制

潘 威

遼寧中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，遼寧 沈陽 110003

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性炎性疾病，其病因不明確，屬疑難雜癥，近年來發(fā)病率逐漸上升，任何年齡均可發(fā)病，老年人發(fā)病率高[1-3］。UC好發(fā)于結(jié)、直腸，表現(xiàn)為結(jié)、直腸黏膜連續(xù)性彌漫性炎癥，周期性交替發(fā)作，病程遷延反復。主要癥狀為腹痛、腹瀉及黏液膿血便，出血嚴重可導致貧血、營養(yǎng)不良等全身癥狀，部分可能發(fā)展為結(jié)腸癌[4-5］。目前世界范圍內(nèi)尚無治療UC 的指南或共識，臨床多應用美沙拉嗪、巴拉西亭、類固醇等藥物進行治療，此外還有替代補充療法，如糞便移植、益生菌移植等[6-9］。但此類療法容易發(fā)生并發(fā)癥，且存在一定選擇標準、安全性等問題[10-11］。

潰瘍性結(jié)腸炎屬于中醫(yī)學“久痢”“休息痢”等范疇。《素問·太陰陽明論篇》云：“大腸屬腑，瀉而不藏，多實多熱。”[12］《東垣十書》中闡述：“夫腸澼者，為水谷與血另作一派……時值長夏，濕熱大盛……而主氣弱，故腸澼之病甚。”[13］UC 在臨床上多表現(xiàn)為熱證，是由于大腸濕熱、熱毒所導致的里急后重、肛門灼熱等癥狀[14-15］。醫(yī)學家多應用清解法，大量應用大黃、黃連等苦寒堅陰藥物來清利大腸濕熱，效果頗佳[16-17］。近年來，以大黃組方的方劑如大黃牡丹湯等廣泛應用于臨床，獲得了滿意的效果[18-19］。大黃中含有多種化學成分，對于哪些成分通過什么途徑發(fā)揮治療UC 的作用研究較少，本研究基于網(wǎng)絡藥理學探討大黃治療UC 的有效化學成分及作用靶點、途徑，以期探索大黃對UC的作用機制。

1 資料與方法

1.1 篩選關鍵化學成分通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/index.php）檢索大黃的全部有效成分，共收集92 種化合物，再通過口服生物利用度（oral bioavail-ability，OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，對化合物的藥物動力學進行篩選，其中，OB是指藥物經(jīng)口服給藥后被機體吸收進入血液循環(huán)的相對量和速率；DL 反映化合物中特定的功能基團與已知藥物的相似性，二者對中藥化學成分活性的評估具有重要意義。

1.2 篩選大黃-潰瘍性結(jié)腸炎共同作用靶點利用TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索大黃關鍵化學成分的靶點信息，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）查詢與靶點相對應的人類基因名稱，再與通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）篩選出的潰瘍性結(jié)腸炎的蛋白靶點基因進行映射，得到藥物-疾病靶點基因。

1.3 藥物-關鍵化學成分-疾病靶點的網(wǎng)絡可視化為了研究大黃治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制，本研究將大黃-潰瘍性結(jié)腸炎的共同化學成分和共同蛋白靶點基因?qū)隒ytoscape3.7.2 軟件進行可視化處理，在藥物-關鍵化學成分-疾病靶點以網(wǎng)絡圖的形式呈現(xiàn)出來。在這個網(wǎng)絡圖中，鍵化合物和靶點以節(jié)點表示，節(jié)點之間相互作用的關系以邊來表示。

1.4 PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建PPI 即蛋白間相互作用關系（protein-protein interaction）的網(wǎng)絡將大黃與潰瘍性結(jié)腸炎的共同靶點基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù) 庫（https：//string-db.org/Version 10.5），選擇研究物種為人類（homo sapiens），得到蛋白互作關系網(wǎng)絡，將蛋白關系評分設為0.7，并隱藏出現(xiàn)的游離蛋白，下載PPI 蛋白互作關系圖，并篩選排名前15的PPI網(wǎng)絡核心基因。

1.5 GO（gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析通過Bioconductor 數(shù)據(jù)庫（http：//bioconductor.org/bioc Lite.R）查詢藥物-疾病共同靶點基因的基因ID。利用R 語言安裝Bioconductor 平臺相關安裝包，設置pvalue=0.05，qvalue=0.05 進行GO富集分析和KEGG富集分析，輸出結(jié)果并繪制barplot柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 大黃中化學成分的篩選通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得大黃的有效化合物共92 種，再經(jīng)OB≥30%，DL≥0.18 標準進行篩選，得到大黃的有效化合物16 種，包括大黃酸、蘆薈大黃素、兒茶素、β-谷固醇、澤蘭黃醇、決明內(nèi)酯等。見表1。

表1 大黃中的有效化學成分

2.2 藥物-疾病靶點預測通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢大黃有效化合物的靶點信息，通過UniProt 進行基因ID的注釋。通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索UC的靶點基因，輸入“Ulcerative colitis”，獲取相關性評分大于5的基因共945個，將大黃與UC 的靶點基因進行映射，得到大黃-UC 的共同靶點共25個，并通過R語言繪制venn圖，見圖1。記錄共同靶點所對應的大黃關鍵化合物，最終得到大黃-UC 的關鍵化學成分共6 個，分別為大黃酸、蘆薈大黃素、兒茶素、β-谷固醇、澤蘭黃醇、決明內(nèi)酯。大黃-UC 的共同靶點基因分別為NOS2、PTGS2、ESR2、PRSS1、KDR、PTGS1、JUN、ESR1、CHEK1、SLC6A4、BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8、PON1、CDKN1A、TNFSF15、FASN、PCNA、MYC、IL1B、PRKCD、CCNB1、PPARG。見圖1。

2.3 藥物-關鍵化學成分-疾病網(wǎng)絡的構(gòu)建通過Cytoscape 3.7.2 軟件將藥物-關鍵化合物-疾病-靶點基因網(wǎng)絡進行可視化處理，見圖2。

2.4 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡分析將大黃-UC共有的25個靶點基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫平臺，研究物種選擇人類，獲取蛋白質(zhì)相互作用關系，篩選評分＞0.4的蛋白關系，并繪制蛋白互作關系網(wǎng)絡圖。該網(wǎng)絡包括25個節(jié)點，102條邊，其中評分≥0.98的互作蛋白為CASP8-CASP3、CDKN1A-PCNA、MYC-CDKN1A、BCL2-CASP8、CASP8-CASP9、CDKN1A-CCNB1、MYCJUN、MYC-ESR1、CDKN1A-JUN、CDKN1A-CASP3。這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡中非常重要，通過計算每個基因連接節(jié)點的數(shù)目，找出前15個PPI核心基因，為MYC、CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、CASP8CASP 9、IL1B、CCNB1、CDKN1A、CHEK1、PPARG、BAX、NOS2、BCL2。這些即為大黃治療UC 的核心基因，見圖3—4。

2.5 GO 功能富集分析GO 富集分析結(jié)果顯示共獲得43條GO生物學過程，排名靠前的生物學功能主要為半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程（3個靶點CASP9/CASP3/CASP8）、雌激素受體結(jié)合（3個靶點ESR1/PCNA/PPARG）、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合（3 個靶點CASP3/CASP8/TNFSF15）、核受體活性（3 個靶點ESR2/ESR1/PPARG）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合（3 個靶點ESR2/ESR1/PPARG）、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)劑活性（3 個靶點CASP3/CDKN1A/CCNB1）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（5 個靶點JUN/BCL2/CASP8/CDKN1A/CCNB1）、類固醇激素受體活性（3 個靶點ESR2/ESR1/PPARG）、BH 域綁定（2個靶點BCL2/BAX）、死亡域結(jié)合（2個靶點BCL2/BAX），說明大黃可以通過多種生物學調(diào)控過程發(fā)揮治療UC的作用。見圖5。

2.6 KEGG 通路富集分析KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，半夏治療直腸癌的關鍵基因靶點主要富集的通路有17條，主要通路涉及p53信號通路、多種凋亡通路、鉑耐藥通路、細胞凋亡通路、細胞周期通路、VEGF 信號通路、細胞衰老通路、壞死性通路、ErbB 信號通路、MAPK 信號通路、NF-κB 信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等，見圖6。

3 討論

腸道微環(huán)境對機體發(fā)揮著多種重要的生理調(diào)節(jié)作用，腸道菌群的抗原對腸道內(nèi)的免疫細胞具有一定的刺激作用，可以刺激產(chǎn)生多種細胞因子，其中促炎因子與抗炎因子之間的動態(tài)平衡維持著腸道以及整個機體的穩(wěn)態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，UC 患者在發(fā)病過程中，上述細胞因子之間的平衡被打破，腸道微生態(tài)發(fā)生混亂[20-21］。大黃分布于陜西、甘肅、四川等地，為蓼科大黃屬，味苦、性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，具有瀉火、清熱解毒、活血祛瘀、利水、清化濕熱的功效。《本草綱目》云：“主治下痢亦白，里急腹痛，小便淋瀝，實熱燥結(jié)，潮熱譫語，黃疸，諸火瘡。”[22］大黃含有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚等化合物，主治腹痛、瀉痢不爽、腸癰疔瘡等。

本研究中，共檢索出大黃治療UC 的關鍵化合物6 種，包括大黃酸、蘆薈大黃素、兒茶素、β-谷固醇、澤蘭黃醇、決明內(nèi)酯。大黃酸又名大黃苷，具有免疫抑制作用和抗炎作用，大黃酸能抑制機體產(chǎn)生抗體，有研究表明它能減輕免疫器官的質(zhì)量，降低機體白細胞數(shù)目，此外，大黃酸還具有抗腫瘤、抗菌、利尿的作用[23-24］。蘆薈大黃素是大黃的有效抗菌成分，對葡萄球菌、炭疽、鏈球菌、痢疾桿菌等均有強大的抑制作用，其免疫抑制作用能夠降低腹腔巨噬細胞的功能，它對肝癌、肺鱗癌、胃癌等腫瘤具有較強活性，抗癌范圍廣泛，對白血病細胞亦具有抑制作用[25-26］。兒茶素又名兒茶酸，廣泛存在于茶葉中，其直接抗菌作用較強，具有廣譜性和高效性，能夠增強細菌細胞膜的通透性，造成細菌死亡，還可影響細菌的基因表達。有研究發(fā)現(xiàn)兒茶素可產(chǎn)生過氧化氫，誘導katB、sodM 等基因上調(diào)，增強細胞對氧化應激和DNA 損傷的抵抗作用[27-28］。β-谷固醇通常用于降血清膽固醇，具有解熱抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，同時對肺纖維化的損傷具有修復作用[29］。本研究通過PPI蛋白互作分析，得到15 個PPI 核心基因，分別為MYC、CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、CASP8CASP9、IL1B、CCNB1、CDKN1A、CHEK1、PPARG、BAX、NOS2、BCL2。這些即為大黃治療UC的核心基因。

本研究通過GO 生物學功能富集分析和KEGG通路富集分析靶點在基因功能和信號通路方面作用。上述PPI 核心基因可以通過半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程而起到治療UC的作用。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，大黃治療UC 的靶點基因主要富集的通路涉及p53 信號通路、ErbB 信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。p53 基因是人體的抑癌基因，能夠促進血細胞凋亡，組織細胞周期，它誘導的磷酸酶對機體炎癥具有調(diào)節(jié)作用[30-31］。MAPK 與細胞增殖、免疫調(diào)控相關，宿主細胞可通過抑制MAPK來抑制病毒的活性[32］。NF-κB信號通路與調(diào)節(jié)機體對感染的免疫應答有密切關系，NF-κB的調(diào)節(jié)作用錯誤會導致出現(xiàn)炎癥、癌癥、自身免疫性疾病及感染性休克等，NF-κB 信號通路可激活TNF 通路和IL 通路，后者與機體炎癥反應和免疫能力密切相關[33-34］。PI3K-Akt是經(jīng)典信號通路，參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞功能，有研究[35-36］表明，在內(nèi)毒素癥小鼠模型中，PI3K-Akt 信號通路在凝血激活和先天免疫應答中產(chǎn)生了作用，同時與機體內(nèi)巨噬細胞數(shù)量增加有關。有研究顯示，HIF-1 可以通過依賴性方式調(diào)節(jié)細胞因子的平衡，進而控制腸道炎癥，HIF-1 的表達與小鼠結(jié)腸炎的嚴重程度密切相關[37］。可見，大黃可以通過抑制炎癥反應，改善機體免疫能力的方式治療UC。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法，闡述了大黃的有效活性成分及靶點基因與UC 作用通路的關系，分析了大黃治療UC 的復雜作用機制，為未來更深入的實驗奠定了基礎。