探討芪葵顆粒干預2 型糖尿病合并骨質疏松大鼠的實驗研究*

婁 妍，余 旭，孫心怡，繆鋆鋆，徐巍龍，查 敏

江蘇省中醫院/南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029

研究[1］表明，2 型糖尿病患者近20%合并骨質疏松，由于該類患者普遍合并神經病變等高風險因素，加之骨組織纖維結構的改變，骨骼脆性增加，骨折的發病風險較正常人群顯著增高。2 型糖尿病合并骨質疏松患者最常發生骨折的部位為胸腰椎、橈骨遠端、足踝和髖關節，均為人體負重結構，一旦發生骨折則將較長時間喪失勞動能力。此外，該類患者常存在手術切口不愈合、感染等并發癥，給臨床治療帶來難題。芪葵顆粒是南京中醫藥大學附屬醫院院內制劑。本研究擬通過動物實驗，探究芪葵顆粒對2 型糖尿病合并骨質疏松大鼠糖脂代謝指標的干預作用，同時探究芪葵顆粒對大鼠MSCs 分化的誘導方向，以期為臨床治療2型糖尿病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雌性SD大鼠18只，體質量200～250 g，12周齡，購于南京青龍山實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK-2019-0106。飼養于南京中醫藥大學動物實驗中心，飼養條件：清潔級。本研究由南京中醫藥大學附屬醫院動物倫理委員會批準。

1.2 藥品及試劑芪葵顆粒由江蘇省中醫院藥房提供。鏈尿佐菌素（Biosharp 公司，批號：BS185）；地塞米松磷酸鈉注射液（湖北藥業有限公司，批號：50-02-2，規格：5 mg/支）；青霉素G（利康藥業，批號：61-33-6，規格：80 萬U/支）；慶大霉素（利康藥業，批號：1403-66-3，規格：8 萬U/支）；胎牛血清（Gibco，規格：500 mL/瓶）；L-DMEM 培養基（Cyagen公司）；SD大鼠BMSC成骨誘導培養基及成脂誘導培養基（Cyagen 公司）；蘇木素、伊紅（四季青公司）；茜素紅、油紅O 染液、噻唑藍、DMSO、Percoll、BGP 及B-ALP 試劑盒（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 實驗儀器37XC 型倒置相差顯微鏡（上海光學儀器廠）；JB-P5 型石蠟包埋及脫水機（武漢俊杰電子公司）；RM2016 型石蠟超薄切片機（武漢俊杰電子公司）；Image-pro plus 6.0（IPP）；恒溫恒濕孵育箱（Heraeus）。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模及分組 將18只雌性SD大鼠隨機分為假造模組、模型對照組及治療組，每組6 只。假造模組進行假手術并注射等量生理鹽水。模型對照組及治療組使用卵巢切除術+鏈尿佐菌素（streptozotocin，STZ）的方法進行造模。空腹血糖＞16.7 mmol/L，默認為造模成功。

1.4.2 干預方法 芪葵顆粒灌胃劑型制備方法：芪葵顆粒根據實驗動物與人按體表面積等效量換算比率計算給藥劑量為：2.7 g/kg。治療組造模后每日予芪葵顆粒，假造模組、模型對照組給予等量生理鹽水，共干預3周。

1.5 觀察指標

1.5.1 血糖、血脂、體質量及骨密度測定 造模及干預完成后，測定各組大鼠血糖（glucose，Glu）、體質量（body weight，BW）、甘油三酯（triglyceride，TG）、骨密度（bone mineral density，BMD）值。

1.5.2 間充質干細胞的提取和培養 將各組大鼠股骨近端髓腔直接在無菌條件下放于L-DMEM培養基中沖洗，沖出的骨髓細胞懸液離心半徑30 cm，1000 r/min 離心10 min，棄上清、脂肪及雜質，加入少量DMEM 重懸，沿離心管壁緩慢滴入含等量體積的Percoll（密度為1.073 g/mL）分離液中，離心半徑30 cm，1500 r/min 離心10 min。取中間云霧狀細胞層置于另一離心管中，PBS沖洗2次后把得到的有核細胞進行培養，換液3 次后MSCs 則得以純化。采用配制而成的L-DMEM 培養基（含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素），將純化的MSCs以1×104/cm2的濃度接種于該培養基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每3天換液1 次，細胞達90%融合后以0.25%胰蛋白酶消化，各組傳代前凍存部分原代細胞備用。

1.5.3 茜素紅染色鈣礦化結節計數 使用成骨誘導培養基對各組MSCs 進行培養，誘導18 天，以Tris-Hcl 配制茜素紅溶液至pH 4.0 染色30 min，200倍鏡下隨機選取6個視野，對紅染鈣礦化結節進行計數。

1.5.4 油紅O染色脂肪細胞計數 使用成脂誘導培養基對各組傳代一次的MSCs 進行成脂誘導12天。油紅O 染液浸染30 min，蘇木素染液浸染1 min，200 倍鏡下隨機選取6 個視野，對紅染脂肪細胞進行計數。

1.5.5 BGP及B-ALP定量 各組MSCs按1×104/孔接種在36孔板上，每組6孔，成骨誘導培養基培養2周，使用B-ALP ELASA試劑盒進行檢測，將各組上清吸取約50 μL，加入樣本孔，而后加入HRP100 μL，37℃孵育60 min，棄去液體，拍干，洗滌液洗滌，反復5次。每孔加入底物50 μL，37℃避光孵育15 min，每孔加入終止液KOH 50 μL，酶聯免疫監測儀測各孔450 nm波長的OD值。

1.5.6 MTT測定吸光度值 取各組BMSCs0.25%胰蛋白酶消化，以5×103/孔接種于96 孔板后移入37℃、5%CO2、飽和濕度標準培養箱中連續培養10天，分別于第1、3、5、7、10天加入MTT（5 g/L）20 μL/孔，4 h 后每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，于酶標儀450 nm 波長測定各孔吸光度值。以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.6 統計學方法實驗數據均使用SPSS 22.0軟件進行統計處理，計量資料用xˉ±s表示，采用重復測量數據的方差分析，LSD 法進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血糖、血脂、體質量及骨密度與模型對照組比較，治療組血糖降低、骨密度增高（P＜0.05）；體質量、甘油三酯兩組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血糖、血脂、體質量及骨密度比較（xˉ±s）

2.2 鈣結節及脂肪結節計數治療組與假造模組茜素紅染色均可見大量礦化的鈣結節，兩組鈣結節數目比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示骨新生活躍。而模型對照組礦化鈣結節數目較少，與其他兩組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。治療組及假造模組均可見少量紅染脂肪細胞，數目比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而模型對照組脂肪細胞數顯著多于其他兩組（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 各組大鼠鈣結節及脂肪結節計數比較（xˉ±s） 個/HP

2.3 BGP 及B-ALP 定量各組BMCSs 成骨誘導后，模型對照組BGP及B-ALP含量均顯著低于假造模組（P＜0.05），而芪葵顆粒組的BGP及B-ALP水平顯著提高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 MTT 測定以假造模組為參照，模型對照組各時間段OD450 比值均顯著降低（P＜0.05），治療組OD450 比值均顯著較模型組提高（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

在本研究中，造模后大鼠與假造模組相比，呈現典型的糖脂紊亂現象及顯著的骨質疏松表現，表現為血糖升高，體質量增加，同時骨密度顯著降低。給予芪葵顆粒干預后，模型大鼠的血糖顯著降低，骨密度顯著升高，體質量及甘油三酯未見明顯改善，可能與研究干預周期較短有關。為進一步明確芪葵顆粒干預2 型糖尿病合并骨質疏松的效用機理，我們對各組大鼠股骨髓腔MSCs 進行了培養及成骨成脂誘導分化，結果顯示，芪葵顆粒能顯著誘導MSCs 向成骨方向分化，促進鈣結節形成，同時降低MSCs 向脂肪方向分化，干預MSCs 的效應明顯。同時，通過ELISA 研究證實，芪葵顆粒能顯著提高成骨誘導關鍵蛋白BGP 及B-ALP 表達水平。此外，MTT 實驗證實芪葵顆粒還能顯著提高MSCs的傳代和增殖活性，保持細胞干性。

流行病學研究顯示，糖尿病患者較健康人群同年齡段合并骨質疏松的比例顯著增高[2］。研究[3］發現，隨著2 型糖尿病患者病程的延長，骨折的發生風險將增加1.7～2.2 倍。醫學界認為，糖尿病微血管病變可使各處骨小梁出現微血管循環障礙，產生缺血缺氧病理改變，致使骨密度降低導致骨質疏松[4］。除較為宏觀的血運因素外，代謝組學方面的改變也在2 型糖尿病患者并發骨質疏松過程中發揮了重要作用，高糖高滲透壓可導致糖基化終末產物增加[5］，而糖基化終末產物的不斷蓄積被證實可抑制MSCs 向成骨細胞的分化，并誘導成骨細胞凋亡和破骨細胞形成，導致骨質疏松發生[6］。因此，改善MSCs細胞分化，有助于干預2型糖尿病并發的骨質疏松。

芪葵顆粒主方由生黃芪、制首烏和黃蜀葵花等中藥組成[7］，是江蘇省中醫院經典制劑，長期用于2 型糖尿病的早期干預和并發癥的治療。方中黃芪甘溫、補中益氣、升陽止渴、利水消腫[8-9］；制首烏補血養精、滋補肝腎、補虛而不滋膩[10］，二藥配用，補益先天之本與后天之本，調氣補血并重；配以黃蜀葵花，活血利尿消腫，補瀉同施，標本兼顧[11］。基于網絡藥理學圖譜，方劑的主要效用成分超過20 種，包括金絲桃苷、槲皮素、黃芪甲苷、二苯乙烯苷等。其中金絲桃苷及槲皮素具有顯著的抗骨質疏松作用[12］。

綜上所述，本研究初步證實，芪葵顆粒除能顯著改善2 型糖尿病血糖指標外，還能有效干預糖尿病性骨質疏松，具有良好的臨床應用前景和進一步深入研究的價值。