屏風四妙湯治療復發性外陰陰道假絲酵母菌病小鼠模型療效及機制研究*

宋桂紅，邢冬杰，劉陶然

山東中醫藥高等專科學校，山東 煙臺 264199

外陰陰道白色念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是常見的婦科疾病，雖然該病病原體明確，治療效果明顯[1-2］，但仍有5%的復發率[3-5］。由于外陰瘙癢嚴重影響了RVVC 患者的工作、生活質量及身心健康[6］，如何提高RVVC 治愈率、減少復發率是目前RVVC 的研究重點。中醫認為RVVC 病機為濕熱內蘊、下注陰中，正氣不足，濕性黏滯、熱與濕合、膠著難除是RVVC 病情纏綿難愈的重要原因[7］。玉屏風散與四妙丸均為中醫傳統名方。玉屏風散補氣固表，具有調節人體免疫力的功效[8］；四妙丸具有補腎健脾，清熱除濕的作用[9］。二方相合組成的屏風四妙湯，具有扶正祛邪、標本兼治的功用，對RVVC 的復發有著良好的預防與治療作用。本研究將屏風四妙湯用于不同免疫狀態小鼠，以探究其對RVVC的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇ICR雌性小鼠120只，8～10周齡，體質量23～27 g，購自武漢華聯科有限公司，實驗動物許可證號：SYXK（鄂）2018-0104，動物實驗遵循3-R 原則。飼養條件：飼養房溫度控制在25℃，空氣濕度維持在40%～60%，采取人工光照，晝夜各12 h。

1.2 藥物及試劑ATCC10231白色念珠菌標準株（上海復祥生物科技有限公司，批號：201903041）；防風、黃芪、白術、黃柏、蒼術、牛膝和薏苡仁等中藥均由山東中醫藥高等專科學校附屬醫院中藥房提供；辣根過氧化酶標記抗體（上海迪申生物技術有限公司，批號：191013）；沙堡葡萄糖瓊脂培養基（上海麗臣生物科技有限公司，批號：1086835）；CD11c+抗體（艾博抗有限公司，貨號：EP1347Y；批號：ab52632）；EliVision plus 試劑盒（中國福州邁新生物科技有限公司，貨號：kit-9902，批號：191124）；DAB Kit（中國福州邁新生物科技有限公司，貨號：DAB-1031，批號：191014）；蘇木素染色液（中國南京建成公司，批號：200526）；檸檬酸鈉緩沖液（中國福州邁新生物科技有限公司，批號：190811）；蘇木素-伊紅染液試劑盒（中國福州邁新生物科技有限公司，批號：190919）。

1.3 實驗儀器101AS-3型干燥箱（日本Olympus公司），BCD-258A/C 型冰箱（盛世元和公司）；BX41型生物倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；E200 型天平（德國賽多利斯）；耐高溫塑料染色架（中國福州邁新，貨號：RAK-2001）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 將120只ICR小鼠適應性喂養1 周，采用隨機數字表法分為A、B、C 組，每組16只；D、E、F組，對照組，每組18只。

1.4.2 模型制備 白色念珠菌采用陰道內接種：接種時取20 μL 真菌懸液（即白色念珠菌孢子接種量為5×104），在接種日注入所有小鼠陰道內，接種后倒置5 min 防止菌液溢出。1）A、B 組于接種白色念珠菌前10 天開始每只小鼠隔日皮下注射1 mg/mL苯甲酸雌二醇油劑0.1 mL，構建為雌激素化接種白色念珠菌組。2）C、D 組均于接種白色念珠菌前1 天、接種日、接種后1 天給予地塞米松（成都天臺山制藥有限公司，批號：20191014，規格：0.5 mL/支）腹腔注射0.15 mL，構建免疫抑制接種白色念珠菌組。3）E、F 組隔日皮下注射植物油0.1 mL，構建為正常免疫組。4）A、C、E各組小鼠接種白色念珠菌前10 天開始灌服屏風四妙湯煎劑（10 g生藥/kg體質量），為中藥干預組。5）B、D、F各組小鼠灌服等體積生理鹽水。

1.4.3 試藥制備 將防風、黃芪、白術各30 g，黃柏10 g，蒼術、牛膝、薏苡仁各15 g 放入不銹鋼鍋中，加純凈自來水700 mL，浸泡30 min，煎取藥液300 mL；二煎加開水400 mL，煎取藥液200 mL。合并藥液，濃縮為150 mL、過濾，濾液加蒸餾水調制藥物濃度0.125 mg/mL，4～8℃冰箱中保存備用。

1.4.4 藥物干預 除對照組外各組小鼠陰道接種白色念珠菌。接種菌量5×104；A 組雌激素+中藥處理10 天；B 組雌激素處理10 天；C 組地塞米松3 次+中藥處理10 天；D 組地塞米松處理3 次；E 組植物油+中藥處理10 天；F 組植物油處理10 天；其中A、C、E各組小鼠接種白色念珠菌前10天開始灌服屏風四妙湯煎劑（10 g 生藥/kg 體質量）；B、D、F各組小鼠灌服等體積生理鹽水。

1.5 觀察指標

1.5.1 IHC法檢測小鼠陰道內CD11C+水平[10］治療結束后，以斷頸法處死小鼠，摘取其陰道組織，用剪刀剪碎后，經過石蠟切片、抗原修復、滅活酶、封閉、加入抗體CD11C+抗體稀釋倍數（1∶500），加入增強劑，使用二氨基聯苯胺（diamino benzidine，DAB）溶液顯色、蘇木素染液復染、脫水封片在400 倍的光學顯微鏡下觀察，取3個表達區域拍照保存。

1.5.2 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察小鼠病理情況[11］摘取小鼠陰道組織，置于4%多聚甲醛固定，然后常規石蠟包埋，HE 染色，根據陰道黏膜組織炎性浸潤、充血、水腫情況進行評分，每種病理損傷以0～4 分評估，得分越高表示組織病理損傷越嚴重。

1.5.3 碘酸雪夫染色（periodic acid-schiff stain，PAS）觀察小鼠病理情況[12］摘取小鼠陰道組織，常規石蠟包埋、切片、脫蠟、復水，蒸餾水清洗10 min，Schiff 氏液染色10 min，流水沖洗5 min，蘇木素染色3 min，再次脫水、透明，封片在400 倍的光學顯微鏡下觀察，取3個表達區域拍照保存。

1.6 統計學方法采用SPSS 23.0 軟件進行數據分析，計量資料采用xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD11c+免疫組化圖由免疫組化圖片可以看出，對照組大面積被染成棕黃色，陽性細胞較多；C組陽性細胞數量最少，其次為A、B、D、F、E組。見圖1。

2.2 CD11c+值檢測各組CD11c+表達可以發現，與對照組光密度值比較，A、B、D、C、F、E 組光密度值下降（P＜0.05），其中C組最顯著。見圖2。

2.3 病理損傷評分與對照相比，A、B、C、D、E、F組小鼠病理評分總分顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠病理損傷評分比較（±s） 分

表1 各組小鼠病理損傷評分比較（±s） 分

注：*表示與對照組比較，P＜0.05

組別對照組A組B組C組D組E組F組黏膜上皮細胞鼠數18 16 16 16 18 18 18糜爛0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00潰瘍0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00炎性浸潤0.00±0.00 0.64±0.48 0.83±0.95 0.38±0.48 1.00±1.73 1.67±1.53 1.00±1.00黏膜下組織充血0.20±0.15 0.30±0.00 0.37±0.25 0.63±0.25 0.50±0.50 0.67±0.57 0.67±0.58炎性浸潤0.15±0.18 0.25±0.00 0.38±0.25 0.38±0.48 0.50±0.50 0.50±0.50 0.67±0.58水腫0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00總分0.38±0.16 1.10±0.26*1.75±0.96*1.38±0.63*2.00±2.65*2.00±2.65*2.33±2.08*

2.4 小鼠HE 染色和PAS 染色圖經HE 染色和PAS 染色圖顯示，對照組小鼠陰道黏膜被覆扁平上皮、表面無明顯角化、無潰瘍、無糜爛，黏膜下組織無明顯充血、炎性浸潤和水腫情況。A 組陰道黏膜上皮角化程度、炎細胞浸潤程度減輕；B 組陰道黏膜上皮角化、無潰瘍糜爛、輕微炎細胞浸潤；C組陰道黏膜上皮部分有不均勻皮角化、無糜爛潰瘍、輕度炎細胞浸潤，黏膜下組織輕度充血、炎細胞浸潤；D 組陰道黏膜上皮角化厚薄不一、大量炎性細胞浸潤、局部糜爛壞死，黏膜下組織輕度充血、炎性細胞浸潤；E 組陰道黏膜被覆復層扁平上皮、部分角質化、炎細胞浸潤得到改善，黏膜下組織輕度充血、炎細胞浸潤；F 組陰道黏膜被覆復層扁平上皮、角質化、中度炎細胞浸潤、局壞死，黏膜下組織輕度充血、炎細胞浸潤。見圖3。

3 討論

念珠菌性陰道炎是婦科常見病，雖然抗真菌藥物可以有效緩解陰道炎癥，但隨著使用藥物的增加，病菌的耐藥性也會變強[13-14］。因此本研究尋求中藥治療念珠菌性陰道炎以降低真菌的耐藥性。

CD11c 屬于細胞表明的跨膜蛋白，參與免疫應答、炎癥反應和細胞增殖、分化生理過程，CD11c+細胞可以通過影響T 淋巴細胞的分化程度影響機體組織免疫反應。本研究檢測了CD11c+水平，與對照組比較，A 組小鼠CD11c+含量水平顯著降低，黏膜上皮細胞炎性浸潤顯著增強，黏膜下組織炎性浸潤得到了顯著的改善，這是由于A 組灌服屏風四妙湯煎劑，所以可以認為灌服屏風四妙湯煎劑可以降低黏膜下組織炎性浸潤，但對黏膜上皮細胞無明顯改善。與B 組相比，A 組CD11c+顯著升高且黏膜上皮細胞和黏膜下組織炎性浸潤均顯著改善，這是由于服用屏風四妙湯煎劑增強了CD11c+的表達。所有組別中，C 組的CD11c+表達最低，這是由于因為接種了免疫抑制白色念珠菌，使得小鼠陰道中的白色念珠菌減少，同時抑制了陰道內的免疫細胞功能。D組CD11c+水平顯著升高，這是由于D 組沒有接種免疫抑制白色念珠菌，使得小鼠陰道內的細胞免疫未受到抑制，因此使得CD11c+的表達升高。相比D 組，E 組小鼠CD11c+顯著升高，且黏膜上皮細胞中的炎性浸潤顯著升高，說明灌服屏風四妙湯煎劑可以增強小鼠細胞內的免疫，同時CD11c+DC 數目增多且DC 主要分布在上皮細胞。E組小鼠病理評分與D組無顯著差異，但CD11c+水平顯著高于D組，這是由于灌服屏風四妙湯煎劑后，小鼠的細胞免疫受到促進，使得其CD11c+水平升高。相比E 組，F 組小鼠病理學評分顯著升高，但CD11c+水平降低，這是由于E 組和F組均為正常免疫，但E 組小鼠病理損傷較低，這是由于灌服屏風四妙湯煎劑可以有效緩解小鼠病變程度。汪平等[15］研究表明：四妙湯可以有效緩解小鼠病變程度，與本研究得出的結論相一致。

綜上所述，小鼠陰道接種白色念珠菌主要病變為陰道黏膜下充血和炎細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞為主，灌服屏風四妙湯煎劑可以有效緩解白色念珠菌感染小鼠陰道內黏膜充血和炎癥細胞浸潤。