魚藤素上調(diào)Kruppel樣因子15表達(dá)影響卵巢癌SKOV細(xì)胞的增殖和凋亡

趙瑩，丁俊姍，楊慧麗

作者單位：1河南省胸科醫(yī)院體檢中心，河南 鄭州 450000；2鄭州市婦幼保健院，a婦科二區(qū)，b產(chǎn)科二區(qū)，河南 鄭州 450000

卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命健康。卵巢癌的治療以手術(shù)切除和以鉑類為基礎(chǔ)的化療為主，化療耐藥是卵巢癌復(fù)發(fā)和治療失敗的主要原因之一［1］。因此，尋找安全有效的抗腫瘤藥物迫在眉睫。魚藤素是一種從豆科植物中提取的黃酮類化合物，具有抗腫瘤活性。研究顯示，魚藤素可誘導(dǎo)胃癌SGC7901/VCR 細(xì)胞程序性壞死［2］，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲［3］。Kruppel 樣因子（KLFs）作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，在DNA 結(jié)合以及核定位中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Kruppel樣因子15（KLF15）是KLFs家族成員之一，從人腎臟cDNA 文庫中獲得。KLF15 表達(dá)于人體多個(gè)組織，如肝臟、腎臟和骨骼肌等［4］。近年來研究顯示，KLF15在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。如高溫杰等［5］研究表明，KLF15 基因在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖及克隆能力，對(duì)癌細(xì)胞周期進(jìn)程起到阻滯作用，可作為乳腺癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。但目前，有關(guān)KLF15 對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡影響的研究甚少。本研究于2019年3月至2020 年3 月進(jìn)行，探討了魚藤素是否能通過調(diào)控KLF15而影響卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及凋亡，旨在為魚藤素用于卵巢癌的治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑卵巢癌SKOV3 細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，魚藤素（純度>97%）購自美國Selleck 公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基由北京索萊寶科技有限公司提供，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）及二喹啉甲酸（BCA）試劑盒由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供，LipofectamineTM2000 試劑盒及Trizol 試劑由美國Invitrogen 公司提供，KLF15 的小干擾RNA（si-KLF15）、亂序無意義陰性序列（si-NC）以及KLF15過表達(dá)載體（pcDNA-KLF15）、空載體（pcDNA）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供，細(xì)胞凋亡試劑盒由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供，兔抗人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（P21、）細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）以及B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）單克隆抗體均由武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體和山羊抗兔二抗多克隆抗體由武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供，羊抗人KLF15 多克隆抗體由美國Abcam 公司提供，逆轉(zhuǎn)錄、PCR 試劑盒均由深圳晶美生物工程有限公司提供，PCR引物由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇SKOV3細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)在37 ℃、5%二氧化碳、97%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至90%時(shí)，常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞清洗、消化及傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞，1×105個(gè)/孔接種于6孔板，細(xì)胞融合達(dá)到60%時(shí)，以不含胎牛血清的RP?MI 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行更換。將pcDNA-KLF15、pcD?NA、si-KLF15和si-NC轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，以含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行更換，于轉(zhuǎn)染48 h 時(shí)進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證無誤后再收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，均嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.2細(xì)胞分組 未轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞根據(jù)魚藤素劑量分為低劑量魚藤素組（Deguelin-L）、中劑量魚藤素組（Deguelin-M）、高劑量魚藤素組（Deguelin-H）及對(duì)照組（Control）。對(duì)照組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，Deguelin-L、Deguelin-M、Deguelin-H 組細(xì)胞分別用含2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L［6］魚藤素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染pcDNA-KLF15、pcDNA 的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，分別記為pcDNA-KLF15 組和pcDNA 組。用含10μmol/L 魚藤素的培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染si-KLF15、si-NC 的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別記為Degue?lin+si-KLF15組和Deguelin+si-NC組。

1.2.3CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后的SKOV3 細(xì) 胞 以0.5×104個(gè)/孔 接 種 于96 孔 板，按“1.2.2”中分組方法進(jìn)行分組處理，每組3 個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)48 h 時(shí)，每孔加入CCK-8 工作液100μL。繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，應(yīng)用酶標(biāo)儀對(duì)450 nm 處光密度值（OD）進(jìn)行測(cè)定。OD值越小表明細(xì)胞活性越低。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后的SKOV3 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24 孔板，按“1.2.2”中分組方法進(jìn)行分組處理，每組3個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)48 h時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，并收集細(xì)胞。取1.0×106個(gè)細(xì)胞，用PBS進(jìn)行2次清洗，并與500μL結(jié)合緩沖液混勻。依次加入10μL的膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC），5 μL 碘化丙啶（PI），混勻后室溫下避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀嚴(yán)格按凋亡檢測(cè)試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后的SKOV3 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24 孔板，按“1.2.2”中分組方法進(jìn)行分組處理，每組3 個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)48 h 時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，并收集細(xì)胞。常規(guī)加入RIPA細(xì)胞裂解液對(duì)細(xì)胞蛋白進(jìn)行提取，BCA蛋白試劑盒對(duì)蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)，取適量蛋白溶液進(jìn)行蛋白變性后，進(jìn)行SDS-PAGE，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，常規(guī)室溫封閉2 h。分別加入P21（兔抗人單克隆抗體，1∶1 000）、CyclinD1（兔抗人單克隆抗體，1∶2 000）、Bcl-2（兔抗人單克隆抗體，1∶2 000）、Bax（兔抗人單克隆抗體，1∶2 000）、KLF15（羊抗人多克隆抗體，1∶1 000）及GAPDH（兔抗人多克隆抗體，1∶2 000）一抗，4 ℃進(jìn)行24 h 孵育。TBST 洗膜。加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（山羊抗兔多克隆抗體，1∶5 000），室溫孵育1 h。TBST洗膜。加入ELC，暗室顯影、拍照。以GAPDH 為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件對(duì)各蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，并計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)KLF15 mRNA 表達(dá) 未轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板，按照“1.2.2”中分組方法進(jìn)行分組處理，每組3 個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)48 h 時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，并收集細(xì)胞。Trizol試劑對(duì)細(xì)胞總RNA 進(jìn)行提取，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA的純度及濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明快速將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)。引物序列：KLF15 正向引物5'-GCGTAGA GTCHAGCTGCTGAACG-3'，反向 引 物 5'-CGAAAGCTGCGAACCGTCGATGC-3'；GAPDH 正向引物5'-CGAGAGAATCCGCGGACAT-3'，反 向 引 物5'-TTGTGCAATACAGCGTGGAC-3'。以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算KLF15mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以xˉ±s表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析及兩兩比較的SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 魚藤素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較，魚藤素組SKOV3 細(xì)胞活性及CyclinD1 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），P21 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），且具有劑量依賴性（P<0.05）。見圖1，表1。

表1 魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞活性及CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響/±s

表1 魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞活性及CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響/±s

注：Control為對(duì)照組，Deguelin-L為低劑量魚藤素組，Deguelin-M為中劑量魚藤素組，Deguelin-H 為高劑量魚藤素組，P21 為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1，CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白。

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圖1 魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞中CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響

2.2 魚藤素對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，魚藤素組SKOV3細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），且具有劑量依賴性（P<0.05）。見圖2，表2。

表2 魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響/±s

表2 魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響/±s

注：Control為對(duì)照組，Deguelin-L為低劑量魚藤素組，Deguelin-M為中劑量魚藤素組，Deguelin-H 為高劑量魚藤素組，Bcl-2 為B 淋巴細(xì)胞瘤-2，Bax為B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白。①與Control 組比較，P<0.05。②與Deguelin-L 組比較，P<0.05；③與Deguelin-M組比較，P<0.05。

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圖2 魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)魚藤素作用SKOV3細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況；B為Western blotting檢測(cè)魚藤素作用SKOV3細(xì)胞后細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

①與Control 組比較，P<0.05。②與Deguelin-L 組比較，P<0.05。③與Deguelin-M組比較，P<0.05。

2.3 魚藤素對(duì)卵巢癌細(xì)胞KLF15 表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，魚藤素組SKOV3細(xì)胞中KLF15蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），且具有劑量依賴性（P<0.05）。見圖3，表3。

表3 魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞中KLF15表達(dá)的影響/±s

表3 魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞中KLF15表達(dá)的影響/±s

注：Control為對(duì)照組，Deguelin-L為低劑量魚藤素組，Deguelin-M為中劑量魚藤素組，Deguelin-H 為高劑量魚藤素組，KLF15 為Krup?pel樣因子15。①與Control 組比較，P<0.05。②與Deguelin-L 組比較，P<0.05。③與Deguelin-M組比較，P<0.05。

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圖3 魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞中KLF15蛋白表達(dá)的影響

2.4 上調(diào)KLF15 表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響與pcDNA 組比較，pcDNA-KLF15 組SKOV3細(xì)胞活性、CyclinD1 及Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），細(xì)胞凋亡率、P21及Bax蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。見表4，5。

表4 上調(diào)KLF15表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞活性及CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響/±s

表4 上調(diào)KLF15表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞活性及CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響/±s

注：KLF15 為Kruppel樣因子15，pcDNA 為空載體，pcDNAKLF15 為KLF15 過表達(dá)載體，P21 為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1，CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1。

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2.5 下調(diào)KLF15 表達(dá)降低了魚藤素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響與魚藤素+si-NC 組比較，魚藤素+si-KLF15 組SKOV3 細(xì)胞活性、CyclinD1 及Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），細(xì)胞凋亡率、P21 及Bax蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見表6，7。

表5 上調(diào)KLF15表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響/±s

表5 上調(diào)KLF15表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響/±s

注：KLF15 為Kruppel 樣 因 子15，pcDNA 為 空 載 體，pcDNAKLF15 為KLF15 過表達(dá)載體，Bcl-2 為B 淋巴細(xì)胞瘤-2，Bax 為B 淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白。

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表6 下調(diào)KLF15表達(dá)對(duì)魚藤素作用的SKOV3細(xì)胞活性及CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響/±s

表6 下調(diào)KLF15表達(dá)對(duì)魚藤素作用的SKOV3細(xì)胞活性及CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響/±s

注：KLF15為Kruppel樣因子15，Deguelin+si-NC為魚藤素+亂序無意義陰性序列，Deguelin+si-KLF15為魚藤素+LF15的小干擾RNA，P21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1，CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1。

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表7 下調(diào)KLF15表達(dá)對(duì)魚藤素作用的SKOV3細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響/±s

表7 下調(diào)KLF15表達(dá)對(duì)魚藤素作用的SKOV3細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響/±s

注：KLF15 為Kruppel 樣因子15，Deguelin+si-NC 為魚藤素+亂序無意義陰性序列，Deguelin+si-KLF15 為魚藤素+KLF15 的小干擾RNA，Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2，Bax為B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白。

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3 討論

近年來研究顯示，魚藤素可通過調(diào)控多條信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，并且對(duì)正常組織細(xì)胞無明顯損傷，具有良好的應(yīng)用前景［7-8］。如Chen等［9］研究顯示，魚藤素能通過時(shí)間及劑量依賴性發(fā)揮其抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620及RKO增殖的作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與激活p38 MAPK 途徑有關(guān)。Li 等［10］研究顯示，魚藤素通過下調(diào)B 細(xì)胞特異的莫洛尼白血病毒插入位點(diǎn)1（Bmi1）表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Ye等［11］研究顯示，魚藤素通過下調(diào)半乳糖凝集素-1（Galectin-1）的表達(dá)誘導(dǎo)肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。但目前，魚藤素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制還未知。

細(xì)胞增殖異常是惡性腫瘤生物學(xué)特征之一，抑制腫瘤細(xì)胞增殖可延緩腫瘤進(jìn)展。CyclinD1作為一種細(xì)胞周期調(diào)控因子，其高表達(dá)能加速細(xì)胞分裂由G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖［12-13］。而P21作為一種腫瘤抑制因子，其高表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖［14］。本研究顯示，2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的魚藤素作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞活性及CyclinD1 蛋白表達(dá)降低，P21 蛋白表達(dá)升高，這表明魚藤素對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖具有抑制作用。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤臨床治療的一種途徑。促凋亡蛋白Bax 及抗凋亡蛋白Bcl-2 共同參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，Bax 表達(dá)增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2 表達(dá)增加則會(huì)抑制細(xì)胞凋亡［15-16］。本研究中魚藤素可提高SKOV3細(xì)胞凋亡率及Bax蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，并存在劑量依賴性，說明魚藤素具有誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡的作用，可能是潛在的治療卵巢癌的藥物。

KLF15 作為KLFs 家族成員，N 端的絲氨酸和脯氨酸，能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能，有研究表明，KLF15 參與了多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，可能作為腫瘤分子治療的潛在靶點(diǎn)［17-18］。研究顯示，KLF15 蛋白在肺腺癌組織中呈低表達(dá)，且生存率也隨其表達(dá)的降低而降低，上調(diào)其表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，可作為肺腺癌病人的潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后分子標(biāo)志物［19］。KLF15 蛋白在胃癌組織中呈低表達(dá)，其表達(dá)水平與病人臨床分期呈負(fù)相關(guān)，且表達(dá)水平越低，淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越高，上調(diào)KLF15 表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖［20］。本研究通過轉(zhuǎn)染KLF15過表達(dá)載體上調(diào)KLF15 表達(dá)后，SKOV3 細(xì)胞的活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，表明上調(diào)KLF15 表達(dá)對(duì)SKOV3 細(xì)胞增殖具有抑制作用，并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可作為卵巢癌分子治療的潛在靶點(diǎn)。本研究還顯示，魚藤素可促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞中KLF15蛋白及mRNA 的表達(dá)，而下調(diào)KLF15 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)魚藤素抑制SKOV3細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，提示魚藤素能通過上調(diào)KLF15 表達(dá)抑制SKOV3 細(xì)胞的增殖，同時(shí)誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，魚藤素可有效抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可能通過上調(diào)細(xì)胞中KLF15 表達(dá)發(fā)揮作用，具有開發(fā)為治療卵巢癌藥物的潛在價(jià)值。