微小RNA-92a靶向Kru?ppel樣因子2基因促進卵巢癌細胞侵襲的作用

王敏，高湘玲

作者單位：濮陽市人民醫院產科，河南 濮陽 457000

卵巢癌是女性常見的生殖系統惡性腫瘤之一，發病率僅次于宮頸癌、位居第二位［1］。卵巢癌早期癥狀不典型、也缺乏特異性的檢測標志物，因此早期診斷率較低，多數卵巢癌病人確診時已經發展至晚期并錯過了根治性手術治療的機會，整體預后較差、5 年生存率較低［2］。目前，卵巢癌的發病機制尚不十分清楚，這直接影響了診斷標志物、靶向治療藥物的發現。

微小RNA（miR）是近些年卵巢癌發病機制研究的熱點，多種miRs在卵巢癌病人外周血及卵巢癌組織中異常表達，異常表達的miRs能夠靶向調節癌基因的表達并參與腫瘤的發生及發展［3-5］。微小RNA-92a（miR-92a）是一種具有明確促癌作用的miR，卵巢癌相關的研究表明，miR-92a在卵巢癌病人血漿外泌體及卵巢癌組織中均存在表達上調［6-7］，提示miR-92a可能在卵巢癌的發生發展中起到促進作用，但目前仍缺乏miR-92a 調控卵巢癌細胞惡性生物學行為的直 接 證 據。Liu 等［8］關 于miR-92a 的 研 究 表 明，Kru?ppel樣因子2（KLF2）是其靶基因；Wang等［9］的研究則發現抑制KLF2 的表達能夠促進卵巢癌細胞的侵襲?；诖颂岢黾僬f，miR-92a可能靶向抑制卵巢癌細胞中KLF2的表達，進而起到促進癌細胞侵襲的作用。為了驗證這一假說，本研究以卵巢癌細胞系為對象進行了一系列細胞實驗，旨在闡明miR-92a靶向KLF2基因促進卵巢癌細胞侵襲的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞2019 年1 月至2020 年3 月進行本研究。A2780、SKOV3、OVCAR-3卵巢癌細胞株以及HOSEp?iC卵巢上皮細胞株購自中科院上海細胞資源中心。

1.2 試劑miR-92a（序列5’-UAUUGCACUUGU?CCCGGCCUGU-3’）、miR-92a抑制物（序列5’-ACAG?GCCGGGACAAGUGCAAUA-3’）、陰性對照（NC）（序列5’UAGCUGAUCGCUAGGUAGCUC-3’）均購自上海吉瑪公司，空白pcDNA 質粒、過表達KLF2的pcD?NA 重組質粒購自上海生工公司，轉染試劑Lipo?fectamine3000、結晶紫均購自Thermo 公司，miR 提取、反轉錄及熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化公司，細胞裂解液、蛋白定量檢測試劑盒、ECL 顯影試劑盒均購自上海碧云天公司，KLF2特異性一抗購自Abcam 公司，雙熒光素酶報告基因由上海生工公司合成，雙熒光素酶檢測系統購自Promega公司。

1.3 儀器細胞培養箱、離心機均為Thermo 公司，熒光定量PCR 儀為ABI 公司，電泳系統及凝膠成像系統為上海天能公司。

1.4 方法

1.4.1細胞培養 卵巢癌及卵巢上皮細胞株在含有10%胎牛血清的培養基中進行貼壁培養，隔天更換培養基、常規用0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞、重懸后按1∶3比例傳代繼續培養。

1.4.2細胞分組及轉染 SKOV3 細胞接種在培養板中，分組后用轉染試劑進行轉染操作。NC組轉染NC 序 列，miR-92a 抑 制 物 組 轉 染miR-92a 抑 制 物，miR-92a 組轉染miR-92a，pcDNA 組轉染空白pcDNA質粒，pcDNA+miR-92a組共轉染pcDNA 質粒及miR-92a，pcDNA-KLF2+miR-92a 組共轉染過表達KLF2的pcDNA重組質粒及miR-92a。

1.4.3miR-92a 表達的熒光定量PCR 檢測 取A2780、SKOV3、OVCAR-3、HOSEpiC 細胞或NC 組、miR-92a抑制物組、miR-92組SKOV3細胞，用miR提取試劑盒提取細胞中的miR，用反轉錄試劑盒將miR 反轉錄合成cDNA 第一鏈，用熒光定量檢測試劑盒對cDNA 進行熒光定量PCR 擴增反應，反應體系按照說明書配置，反應程序按照說明書設置：95 ℃、3 min 后95 ℃、15 s，60 ℃、34 s 循環40 次。分別對目的基因miR-92a 和內參基因U6 進行擴增，得到擴增的循環曲線及循環閾值（Ct），以U6 為內參、按照公式2-ΔΔCt計算miR-92a的表達水平。

1.4.4細胞侵襲的Transwell檢測 取分組轉染后的SKOV3 細胞，在Transwell 的上層小室內預先加入基質膠，而后將密度為2×105個/毫升的細胞懸液100μL接種在上層小室內，同時在下層小室內加入有10%胎牛血清的培養基0.5 mL、用于趨化上層小室內的細胞發生侵襲。48 h后取出小室，擦去上層小室內未發生侵襲的細胞，用4%多聚甲醛固定30 min后用結晶紫室溫染色15 min，最后在顯微鏡下隨機觀察3個高倍視野，對視野內的細胞進行計數、即侵襲細胞數目。

1.4.5KLF2表達的蛋白質印跡法（Western blotting）檢測 取NC 組、miR-92a 抑制物組、miR-92 組、pcD?NA組、pcDNA+miR-92a組、pcDNA-KLF2+miR-92a組SKOV3細胞，加入裂解液、裂解細胞、提取蛋白，檢測蛋白含量后將30μg蛋白用于Western blotting 檢測，蛋白在聚丙烯酰胺凝膠中電泳、而后電轉移至PVDF膜，將PDVD膜放入5%脫脂牛奶、室溫孵育1 h，而后將PVDF膜放入1∶1 000稀釋的KLF2一抗或1∶5 000稀釋的β-肌動蛋白（β-actin）一抗中，4 ℃孵育過夜。次日，將PVDF膜放入1∶2 000稀釋的二抗中，室溫孵育1 h，最后采用ECL顯影試劑盒在凝膠成像系統中顯影得到KLF2、β-actin的蛋白條帶，以β-actin條帶灰度值為內參、計算KLF2的蛋白表達水平。

1.4.6雙熒光素酶報告基因實驗 構建野生型和突變型神經鈣黏素（N-cadherin）雙熒光素酶報告基因，將報告基因轉染進入SKOV3 細胞后分為NC 組和miR-92a 組，分別轉染NC 序列和miR-92a 序列。持續轉染48 h 后收集細胞，采用雙熒光素酶檢測系統對細胞中螢火蟲及海腎的熒光值進行檢測，計算螢火蟲與海腎熒光值的比值，以該比值作為雙熒光素酶報告基因的熒光活力。

1.5 統計學方法采用SPSS 21.0 軟件錄入數據，多組間計量資料的比較采用方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間計量資料的比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌細胞株中miR-92a 表達的變化與卵巢上皮細胞株HOSEpiC的0.62±0.09比較，卵巢癌細胞株A2780、SKOV3、OVCAR-3 中miR-92a 的表達水平均（0.92±0.15、1.62±0.19、1.21±0.13）明顯增加（F=43.47，P<0.001），且SKOV3 細胞中miR-92a 的表達水平高于A2780 及OVCAR-3 細胞（P<0.05），因此選擇SKOV3細胞進行后續實驗。

2.2 miR-92a 調控SKOV3 細胞侵襲熒光定量PCR 檢測顯示，與NC 組比較，miR-92a 抑制物組SKOV3 細胞中miR-92a 的表達水平明顯降低、miR-92a 組SKOV3 細胞中miR-92a 的表達水平明顯增加（P<0.05）；Transwell 檢測顯示，與NC 組比較，miR-92a 抑制物組SKOV3 細胞的侵襲數目明顯減少、miR-92a 組SKOV3 細胞的侵襲數目明顯增加（P<0.05）。見表1，圖1。

表1 微小RNA-92a（miR-92a）對SKOV3細胞侵襲的影響/x±s

2.3 miR-92a靶向調控KLF2表達Targetscan網站生物信息學分析顯示，KLF2基因mRNA 3’UTR中含有miR-92a的結合位點；Western blotting檢測顯示，與NC組0.42±0.08比較，miR-92a抑制物組SKOV3細胞中KLF2的表達水平0.78±0.20明顯增加、miR-92a組SKOV3細胞中KLF2的表達水平0.29±0.06明顯降低（F=76.57，P<0.001），見圖2。

圖2 KLF2的蛋白條帶

經雙熒光素酶報告基因檢測，miR-92a組SKOV3細胞中野生型KLF2 報告基因的熒光活力0.39±0.09低于NC組0.75±0.20（t=3.67，P=0.006），突變型KLF2報告基因的熒光活力與NC組比較差異無統計學意義（t=0.30，P=0.773）。

2.4 miR-92a 通過KLF2 促進SKOV3 細胞侵襲Western blotting 檢測顯示，與pcDNA 組比較，pcD?NA+miR-92a 組SKOV3 細胞中KLF2 的表達水平明顯降低（P<0.05），與pcDNA+miR-92a 組比較，pcD?NA-KLF2+miR-92a組SKOV3細胞中KLF2的表達水平明顯增加（P<0.05），見圖3；Transwell 檢測顯示，與pcDNA 組 比 較，pcDNA+miR-92a 組SKOV3 細 胞的侵襲數目明顯增加（P<0.05），與pcDNA+miR-92a組比較，pcDNA-KLF2+miR-92a 組SKOV3 細胞的侵襲數目明顯減少（P<0.05），見圖1，表2。

圖1 卵巢癌細胞系接種培養后Transwell檢測侵襲細胞的染色圖（結晶紫染色×200）

圖3 KLF2的蛋白條帶

表2 過表達KLF2對miR-92a促進SKOV3侵襲的影響/x ± s

3 討論

miR-92a 具有促癌作用，多項惡性腫瘤相關的研究發現，卵巢癌［6-7］、肝癌［10］、結直腸癌［11］、膀胱癌［12］、乳腺癌［13］等惡性腫瘤病灶中或病人外周血中miR-19a的表達明顯增加，高表達的miR-19a對食管癌［14］、結直腸癌［15］、宮頸癌［16］細胞的遷移、侵襲等惡性生物學行為具有調控作用。

本研究首先通過細胞株中miR-92a 表達的檢測證實三種卵巢癌細胞株中miR-92a 的表達水平高于正常卵巢上皮細胞株，與既往臨床研究報道的卵巢癌中miR-92a 表達增加的結果吻合。在三種卵巢癌細胞株中，SKOV3 細胞中miR-92a 表達增加的趨勢最顯著。

癌細胞過度侵襲會造成卵巢癌病灶的局部浸潤、腹腔播散及遠處轉移，因此越來越多的基礎研究開始關注卵巢癌細胞侵襲的調控機制。本研究在SKOV3卵巢癌細胞系中通過轉染miR-92a抑制物或miR-92a的方式來抑制或增加miR-92a 的表達，在抑制miR-92a的表達后、SKOV3細胞的侵襲數目明顯減少，而在增加miR-92a 的表達后、SKOV3 細胞的侵襲數目明顯增加，通過抑制及增加miR-92a 表達調控SKOV3細胞侵襲的實驗表明，miR-92a 對SKOV3 細胞的侵襲具有促進作用，與既往關于miR-92a 促進食管癌［14］、結直腸癌［15］、宮頸癌［16］細胞侵襲的報道一致。

本研究還探究了介導miR-92a 這一作用的分子機制。miRs 發揮生物學作用的方式是與靶基因mRNA 3’UTR 結合并抑制靶基因的表達，Liu 等［8］在內皮細胞中研究了miR-92a 的靶基因并發現miR-92a 能夠靶向抑制KLF2 基因的表達。本研究在SKOV3 細胞中發現抑制miR-92a 的表達后、細胞中KLF2 的表達增加，增加miR-92a 的表達后、細胞中KLF2的表達減少；進一步經雙熒光素酶報告基因驗證，過表達miR-92a 能夠使野生型KLF2 雙熒光素酶報告基因的熒光活力降低，根據Targetscan 生物信息學預測結果將KLF2 基因mRNA 3’UTR 中miR-92a 靶向結合的堿基突變后、miR-92a 不影響突變型KLF2 雙熒光素酶報告基因的熒光活力。以上結果表明miR-92a 能夠靶向抑制SKOV3 細胞中KLF2 基因的表達，且miR-92a靶向結合KLF2基因mRNA 3’UTR的位點與Targetscan生物信息學預測一致。

多項研究表明KLF2 能夠抑制肝癌、前列腺癌、肺癌細胞的侵襲，受到KLF2調控的分子和通路包括MMP2、Hedgehog 通路、TGF-β1 通路等［17-20］，KLF2 可能通過抑制相關通路發揮抑制癌細胞侵襲的作用。在SKOV3細胞中，miR-92a能夠促進細胞侵襲、靶向抑制KLF2 表達，由此推測miR-92a 可能通過抑制KLF2 的表達、削弱KLF2 的抑癌作用來達到促進細胞侵襲的效應。為了驗證這一推測，本研究設計了過表達KLF2的重組質粒，在轉染miR-92a抑制KLF2表達、促進細胞侵襲的同時也轉染了過表達KLF2的重組質粒，轉染重組質粒后miR-92a抑制KLF2表達、促進細胞侵襲的作用均發生了逆轉，表明靶向抑制KLF2表達是miR-92a促進細胞侵襲的機制之一。

綜上所述，多種卵巢癌細胞中miR-92a表達增加能夠促進SKOV3細胞侵襲并靶向抑制KLF2基因的表達，是促進細胞侵襲的機制之一。未來miR-92a可能成為研究卵巢癌發病機制及靶向治療手段的分子靶點。