炎癥性腸病的微小RNA-377、微小RNA-31表達及其與腸道菌群相關性

李國東，梁博，何明璇，崔昭，劉亞維

作者單位：1保定市第一中心醫院消化三科，河北 保定 071000；2保定市第二醫院消化內科，河北 保定 071000；3河北大學附屬醫院中西醫結合科，河北 保定 071030

炎癥性腸病是臨床常見的一種消化系統疾病，主要病理類型為克羅恩病與潰瘍性結腸炎。近年來，炎癥性腸病發病率逐年上升，目前關于其發病機制尚未闡明，其主要臨床表現為腹痛、腹瀉等，研究表明炎癥反應、腸道菌群變化在炎癥性腸病發生及發展中發揮重要作用，同時微小RNA（miRNA）表達異常并可參與炎癥性腸病發生及發展過程［1-4］。微小RNA-377（miR-377）在高糖誘導的人腎小球系膜細胞中表達水平升高，敲低其表達可抑制細胞增殖及炎癥反應［5］。微小RNA-31（miR-31）在炎癥性腸病中表達水平升高，但關于其具體作用機制尚未闡明［6］。因此，本研究主要探討miR-377、miR-31在炎癥性腸病血清中的表達及其與炎癥反應、腸道菌群的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016 年5 月至2019 年6 月保定市第一中心醫院收治的110例炎癥性腸病病人為研究組，所有病人均符合炎癥性腸病診斷標準，其中潰瘍性結腸炎75例，克羅恩病35例［7］。其中活動期69 例，男42 例，女27 例，年齡（42.36±7.52）歲，范圍為32～60 歲；緩解期41 例，男23 例，女18 例，年齡（41.58±8.36）歲，范圍為31～62 歲。排除標準：嚴重心腦血管疾病病人；合并自身免疫性疾病病人；合并其他炎性疾病病人。同時選取同院體檢的健康志愿者60 例為對照組，其中男40 例，女20 例，年齡（45.32±9.67）歲，范圍為35～67歲。各組研究對象年齡、性別比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1標本采集 所有研究對象于早晨空腹時分別采集外周靜脈血5 mL，置于促凝管內保存，4 ℃條件下經3 500 r/min 離心10 min，吸取上清，置于-40 ℃冰箱內保存。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-377、miR-31 的表達水平 采用Trizol 法（美國Invitrogen 公司）提取血清總RNA，應用Nano?drop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度，RNA OD260/OD280處于1.8～2.0。miR-377正向引物5’-ATCACACAAAGGCAAC-3’，反 向 引 物5’-GTG?CAGGGTCCGAGGT-3’；miR-31 正 向 引 物5’-GGCATAGCTGTTGAACTGGG-3’，反 向 引 物5’-CGATCGTCAGCATCACTAGC-3’；U6 正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物5’-GTG?CAGGGTCCGA GGTATTC-3’，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。反轉錄體系：5×gDNA Buffer 2μL，10×King RT Buffer 2μL，FastKing RT En?zyme Mix 1μL，FQ-RT Primer Mix 2μL，RNA（2μg），RNase-Free 雙蒸水補足體系至20 μL；反應條件：42 ℃15 min，95 ℃3 min。反轉錄得到cDNA，以cD?NA 為模板進行qRT-PCR 擴增，反應體系：10×PCR Buffer 2.5μL，MgSO42.5μL，dNTPs 2.5μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free 雙蒸水補足體系至25 μL；反應條件：95 ℃預變性60 s，95 ℃變性60 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36 次循環。miR-377、miR-31以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-377、miR-31相對表達量。反轉錄與熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2.3檢測炎性因子IL-34、CRP、PCT 的水平 采用ELISA 法檢測血清白細胞介素-34（IL-34）、C 反應蛋白（CRP）的水平，檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用電化學發光法檢測血清降鈣素原（PCT）的水平，應用羅氏全自動免疫分析儀601進行檢測，檢測試劑盒購自深圳市長征生物科技有限公司。

1.2.4檢測腸道菌群 取病人新鮮糞便0.5 g，稀釋，取10 μL 進行檢測腸道菌群，主要包括腸球菌（EC）、酵母菌（SB）、雙歧桿菌（BL）、消化球菌（PS）、小梭菌（CD）、腸桿菌（EMB）、葡萄球菌（SP）、擬桿菌（BD）、乳桿菌（LC）、真桿菌（ES），采用瓊脂糖培養基進行培養，其中厭氧菌為：BL、PS、BD、ES、CD、LC；需氧菌：EC、SB、EMB、SP。

1.3 統計學方法采用統計學軟件SPSS 21.0 進行分析，符合正態分布的計量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；采用Pearson 法分析miR-377、miR-31 表達量與IL-34、CRP、PCT 水平的相關性，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 炎癥性腸病病人血清中miR-377、miR-31的表達水平與對照組（0.96±0.16、0.97±0.24）比較，研究組血清中miR-377、miR-31 的表達水平（2.23±0.50、2.39±0.41）顯著升高（t=19.13、24.61，均P<0.001）。

2.2 活動期與緩解期病人血清中miR-377、miR-31的表達水平與緩解期（1.70±0.26、2.02±0.19）比較，活動期病人血清中miR-377、miR-31 的表達水平（2.54±0.30、2.61±0.34）顯著升高（t=14.90、10.19，均P<0.001）。

2.3 炎癥性腸病病人血清IL-34、CRP、PCT 水平與對照組比較，研究組血清IL-34、CRP、PCT 水平顯著升高（P<0.05），見表1。

表1 炎癥性腸病病人血清IL-34、CRP、PCT水平/±s

表1 炎癥性腸病病人血清IL-34、CRP、PCT水平/±s

注：IL-34 為血清白細胞介素-34，CRP 為C 反應蛋白，PCT 為血清降鈣素原。

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2.4 miR-377、miR-31 表達量與IL-34、CRP、PCT水平的相關性分析采用Pearson 法分析miR-377、miR-31表達量與IL-34、CRP、PCT水平的相關性，miR-377 與IL-34 呈正相關（r=0.99，P<0.001），miR-377 與CRP 呈正相關（r=0.50，P<0.001），miR-377 與PCT 呈正相關（r=0.86，P<0.001）；miR-31 與IL-34 呈正相關（r=0.95，P<0.001），miR-31與CRP呈正相關（r=0.64，P<0.001），miR-31 與PCT 呈 正 相 關（r=0.85，P<0.001）。

2.5 miR-377、miR-31 表達量與腸道菌群數量的相關性根據表達量平均值將病人分為miR-377低表達組53 例、miR-377 高表達組57 例、miR-31 低表達組57 例、miR-31 高表達組53 例，比較分析miR-377、miR-31 表達量與腸道菌群數量的相關性，結果顯示與miR-377 低表達組比較，miR-377 高表達組SB、BL、LC、EC、BD、PS、SC 的數量明顯升高（P<0.05），ES的數量明顯降低（P<0.05）；與miR-31低表達組比較，miR-31 高表達組SB、BL、LC、EC、BD、PS、SC 的數量明顯升高（P<0.05），ES 的數量明顯降低（P<0.05），見表2。

表2 miR-377、miR-31表達量與腸道菌群數量的相關性/［LgN（CFU/g），±s］

表2 miR-377、miR-31表達量與腸道菌群數量的相關性/［LgN（CFU/g），±s］

注：EC為腸球菌，SB為酵母菌，BL為雙歧桿菌，PS為消化球菌，CD為小梭菌，EMB為腸桿菌，SP為葡萄球菌，BD為擬桿菌，LC為乳桿菌，ES為真桿菌。

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3 討論

炎癥性腸病臨床表現呈多樣化且缺乏特異性，需結合臨床表現、內鏡、血清學指標等檢查結果進行判斷，但易造成誤診或漏診，因而尋找新指標更準確判斷炎癥性腸病的炎癥活動性具有重要意義［8-11］。

本研究結果顯示炎癥性腸病病人血清中miR-377 表達水平顯著升高，且活動期病人血清中miR-377的表達水平高于緩解期。miR-377在炎癥性疾病中表達水平升高，并可參與其發生及發展過程［12］。miR-377 可參與大鼠腦缺血損傷后的炎癥和血管生成過程［13］。下調miR-377 通過上調靶基因SIRT1 表達而抑制缺氧誘導的人視網膜內皮細胞血管生成及炎癥［14］。提示miR-377 在炎癥性腸病發生及發展過程中可能發揮重要調控作用。IL-34屬于新型細胞因子，其可參與機體多種免疫及炎癥性疾病發生過程，IL-34與炎癥性腸病活動指標CRP的水平呈正相關，并可參與炎癥性腸病發生及發展過程［15］。PCT是由多種氨基酸構成的一種降鈣素前體，可作為敗血癥及細菌感染的特異性指標，并可反映全身系統炎性反應［16］。本研究結果顯示炎癥性腸病病人血清IL-34、CRP、PCT 水平顯著升高，與上述研究結果相似。同時本研究進一步分析顯示miR-377與IL-34、CRP、PCT 呈正相關，提示miR-377 可能通過提高IL-34、CRP、PCT水平從而促進炎癥反應的發生。

本研究結果顯示炎癥性腸病病人血清miR-31的表達水平升高，且活動期顯著高于緩解期。miR-31 在類風濕關節炎病人外周血單核細胞中的表達水平升高，并可能作為評估類風濕關節炎疾病活動程度的生物標記物［17］。下調miR-31 表達可抑制結腸炎發展進程［18］。miR-31 在結腸炎中表達水平升高并可促進炎癥反應的發生［19］。與上述研究結果相似，進一步分析顯示miR-31與IL-34、CRP、PCT 呈正相關，提示miR-31可能促進炎癥反應的發生從而誘發炎癥性腸病。腸道菌群失衡是導致炎癥性腸病發病的重要原因之一，腸道菌群失衡還可促進炎癥反應的發生。根據表達量平均值將病人分為miR-377 低表達組53 例、miR-377 高 表達組57 例、miR-31低表達組57例、miR-31高表達組53例，比較分析miR-377、miR-31 表達量與腸道菌群數量的相關性，結果顯示隨著miR-377、miR-31 表達水平的升高SB、BL、LC、EC、BD、PS、SC 的數量明顯升高，而ES 的數量明顯降低。分析原因可能為菌群數量改變或比例失調可導致腸道黏膜功能障礙，其中腸道上皮細胞無法感應菌群并給出錯誤反應從而造成腸道內免疫應答功能紊亂，一般情況下真桿菌與白細胞數等呈負相關，炎癥程度越高則酵母菌數目、腸球均屬數目越高，即不同菌數目失調與炎癥性腸病病人炎癥反應程度密切相關，本研究結果說明miR-377、miR-31 表達水平升高可提高SB、BL、LC、EC、BD、PS、SC的數量，其中SB、EC數量增多可引起炎癥性反應，還可增加代謝產物及毒素從而損害腸道黏膜繼而促進腸道炎癥的發生。提示miR-377、miR-31 可能通過調控腸道菌群而影響IL-34、CRP、PCT水平從而引發炎癥性腸病。

綜上所述，miR-377、miR-31 在炎癥性腸病血清中的表達水平升高，二者均與炎性反應及腸道菌群密切相關，但關于其具體作用機制仍需進一步探究。