止麻消痰活血湯對(duì)老年心肌梗死大鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1/受體酪氨酸蛋白激酶erbB3通路及心室重構(gòu)的影響

王蕊

作者單位：棗莊市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，山東 棗莊 277000

心肌梗死（MI）是臨床常見的心血管疾病，起病急，病情進(jìn)展快，由冠狀動(dòng)脈堵塞引起，救治稍有延誤，即可造成病人死亡，且大多病人會(huì)因心室重構(gòu)等后遺癥而發(fā)展為心力衰竭［1-2］。心梗后心肌組織持續(xù)的缺血缺氧及救治時(shí)的血流再灌注，均可能誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成心肌損傷及纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致心室重構(gòu)，阻止炎癥及氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展是抑制心室重構(gòu)，進(jìn)而改善MI病人預(yù)后的關(guān)鍵［3-4］。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1（NRG-1）在心肌發(fā)育及心功能維持中具有重要作用，可通過激活受體酪氨酸蛋白激酶erbB3（ErbB3）信號(hào)抑制促炎因子表達(dá)，降低氧化應(yīng)激及炎癥水平，緩解MI 導(dǎo)致的心肌肥大，延緩心肌纖維化及病理?yè)p傷，改善心室重塑，由此可知NRG-1/ErbB3 信號(hào)是MI 后心室重構(gòu)的重要治療靶點(diǎn)［5-7］。MI 在中醫(yī)中屬于胸痹心痛，病機(jī)為“陽(yáng)微陰弦”，導(dǎo)致氣滯、血瘀、痰凝，并上乘于心，以具有消痹、化痰、活血功效的中藥方劑可減輕心肌損傷，改善MI 病人臨床癥狀［8-9］。止麻消痰活血湯為著名中醫(yī)藥專家邢月朋自擬方，可治療動(dòng)脈粥樣硬化，減輕肢體麻木，黃芪為方中主藥，可益氣并助力血運(yùn)，改善MI 后心室功能，半夏、膽南星、赤芍、桃仁、甘草等為輔助，能化濁理氣，祛痰化瘀，活血通脈，共奏益氣、化痰、通脈之功［10-11］，但止麻消痰活血湯是否可調(diào)控NRG-1/ErbB3通路，影響老年MI大鼠心室重構(gòu)，目前尚未有詳細(xì)研究闡述。2019 年2—10月進(jìn)行本研究，本研究通過構(gòu)建老年MI 大鼠模型，對(duì)上述問題進(jìn)行探尋研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠［上海邦耀生物公司，許可證號(hào)SCXK（滬）-2014-0002］，76 只，SPF 級(jí)，21 月齡，雄性，體質(zhì)量450～500 g。在本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，室內(nèi)環(huán)境達(dá)到清潔級(jí)，并且安靜、通風(fēng)良好，12 h/12 h 交替光照，溫度為25 ℃左右，相對(duì)濕度為50%左右，大鼠自由飲食、飲水。

1.1.2試劑與儀器 止麻消痰活血湯（地龍、赤芍、當(dāng)歸、黃芪、川芎、雞血藤、桃仁、紅花、清半夏、丹參、烏梢蛇、膽南星、全蟲、陳皮、甘草）購(gòu)自北京同仁堂；地爾硫?（天津田邊制藥有限公司，批號(hào)1701091）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（G1120）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；馬松（Mosson）染色試劑盒（ZY-4422-1）購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；放射免疫沉淀測(cè)定（RIPA）裂解液（高強(qiáng)度）（貨號(hào)W062-1-1）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELASA）試劑盒（A0119）、大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）ELISA試劑盒（A0134）、標(biāo)準(zhǔn)二喹啉甲酸（BCA）法總蛋白定量測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A045-4-2）、大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（A0107）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔源抗大鼠p-ErbB3 一抗（ab101407）、兔源抗大鼠NRG1 一抗（ab32375）兔源抗 大 鼠ErbB3 一 抗（ab32121）、羊 抗 兔 二 抗（ab150077）、兔源抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（ab181602）購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司等。光學(xué)顯微鏡（DM500），德國(guó)Leica公司；多功能酶標(biāo)儀（Varioskan LUX），賽默飛世爾科技有限公司；電子天平（YP2002），北京佳源興業(yè)科技有限公司；小型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（1658033），美國(guó)Bio-Rad公司；低溫高速離心機(jī)（Microfuge 20R），美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（OI-X6），廣州光儀生物科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1制備大鼠MI 模型及分組給藥 參照文獻(xiàn)［12］中方法制備大鼠MI模型如下：取出SD 大鼠，于其腹腔內(nèi)注射40 mg/kg劑量的2%戊巴比妥鈉溶液，待其進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)時(shí)，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)，進(jìn)行氣管插管并連接小動(dòng)物呼吸機(jī)做大鼠心電圖監(jiān)測(cè)，切口大鼠第3、4肋骨之間距離胸骨左緣約0.5 cm處，開胸暴露心臟并找到大鼠左冠狀動(dòng)脈降支，游離后于其根部約1 mm 處穿線結(jié)扎，當(dāng)大鼠心臟左室顏色變白，同時(shí)心電圖顯示ST 波抬高，即預(yù)示模型建立成功，解開去除結(jié)扎線后縫合，消毒并將其隨機(jī)分成五組（每組12只）：模型組、止麻消痰活血湯低劑量組、止麻消痰活血湯中劑量組、止麻消痰活血湯高劑量組、地爾硫?組，另選取SD大鼠12只，開胸游離其左冠狀動(dòng)脈降支后僅穿線不做結(jié)扎，做假手術(shù)組。

將止麻消痰活血湯1劑（地龍10 g、赤芍10 g、當(dāng)歸10 g、黃芪20 g、川芎10 g、雞血藤15 g、桃仁10 g、紅花10 g、清半夏10 g、丹參10 g、烏梢蛇6 g、膽南星10 g、全蟲6 g、陳皮10 g、甘草6 g）水煎，過濾后得到藥液300 mL，分為10 mL 一份，止麻消痰活血湯低、中、高劑量組分別以10 mL/kg、20 mL/kg、30 mL/kg的劑量灌胃［11］，以生理鹽水溶解地爾硫?，制備［13］為0.261 mg/mL 的溶液，地爾硫?組灌胃10 mL/kg劑量的0.261 mg/mL 地爾硫?溶液，模型組和對(duì)照組大鼠灌胃10 mL/kg 的生理鹽水，各組大鼠都每天給藥1次，持續(xù)給藥28 d。

1.2.2測(cè)定大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)及收集標(biāo)本 將給藥完全結(jié)束后24 h 的大鼠麻醉后測(cè)量其體質(zhì)量（記為G），取腹主動(dòng)脈血1.6 mL，收集4 ℃離心后的上清液，作為血清存在-80 ℃?zhèn)溆茫粩囝^處死后解剖分離出大鼠心臟，取下左心室測(cè)量其質(zhì)量（記為G1），計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)=G1/G×10 000%；然后剪下約0.5 g左心室心肌組織，剪碎加入蛋白裂解液混勻，采用勻漿機(jī)上下研磨勻漿，然后收集4 ℃離心20 min后的上清液，得到各組蛋白樣品液存在-80 ℃?zhèn)溆茫皇Ｓ嘧笮氖倚募〗M織進(jìn)行常規(guī)固定、透明、脫水、包埋、切片后，獲得厚約4μm的常規(guī)病理切片以備后用。

1.2.3HE 與Mosson 染色 將“1.2.2”中的病理切片，選取其中完好、厚薄均勻的進(jìn)行脫蠟處理后，以100%～70%梯度酒精溶液浸泡，然后參照HE 及Mosson 染色試劑盒說明書中的指導(dǎo)步驟分別進(jìn)行HE、Mosson染色，常規(guī)漂洗、透明、脫水、封片后以顯微鏡觀察，攝取每張切片任意5個(gè)視野圖像。

1.2.4測(cè)定大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α 水平取出并解凍“1.2.2”中各組大鼠血清，參照ELISA 試劑盒說明書中的指導(dǎo)步驟：96 孔板經(jīng)包被后分組加樣，加酶標(biāo)抗體37 ℃孵育1 h，洗滌后加底物液顯色（37 ℃）30 min，然后終止反應(yīng)并于450 nm 處測(cè)各孔吸光度，進(jìn)而測(cè)定其中TNF-α、IL-6、TGF-β1水平。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法 取出并解凍“1.2.2”中各組大鼠蛋白樣品液，測(cè)定其中蛋白總濃度（具體參照BCA 試劑盒說明書中的指導(dǎo)步驟進(jìn)行），根據(jù)結(jié)果將其調(diào)整至各組相同，取各組相同體積的樣品液分別加入配制好的SDS-PAGE 濃縮膠上樣孔中，跑電泳分離蛋白后濕轉(zhuǎn)，最終將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后采用5%脫脂奶粉溶液封閉，2 h 后截取的目的蛋白NRG-1、p-ErbB3、ErbB3、GAPDH 條帶，分別放入小盒中后加入相應(yīng)的兔源抗大鼠一抗，4 ℃孵育過夜后回收一抗，然后采用TBST 漂洗后加入羊抗兔二抗，室溫孵育2 h 后去除二抗，采用TBST 漂洗后以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，以凝膠成像儀攝取各目的蛋白條帶圖像，最后運(yùn)用Image-J軟件做分析后檢測(cè)各目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 24.0 對(duì)各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并都使用xˉ±s表示，組間差異比較行采用單因素方差分析，兩兩之間進(jìn)一步比較行LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 止麻消痰活血湯對(duì)大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)的影響相比假手術(shù)組，模型組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)顯著升高（P<0.05）。相比模型組，止麻消痰活血湯低劑量、中劑量及高劑量組、地爾硫?組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)降低（P<0.05），止麻消痰活血湯各組之間呈劑量依賴性，相比地爾硫?組，止麻消痰活血湯高劑量組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 SD大鼠72只左心室質(zhì)量指數(shù)比較/（?，±s）

表1 SD大鼠72只左心室質(zhì)量指數(shù)比較/（?，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.001。②與模型組比較，P<0.001。③與止麻消痰活血湯低劑量組比較，P<0.001。④與止麻消痰活血湯中劑量組比較，P<0.001。

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2.2 止麻消痰活血湯對(duì)大鼠心肌組織病理?yè)p傷的影響假手術(shù)組大鼠心肌結(jié)構(gòu)正常、清晰、完好；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌纖維扭曲、斷裂，心肌細(xì)胞肥大、壞死，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷；相比模型組，止麻消痰活血湯低劑量、中劑量及高劑量組、地爾硫?組大鼠心肌病理?yè)p傷減輕，且止麻消痰活血湯各組之間逐漸減輕，止麻消痰活血湯高劑量組與地爾硫?組相比，大鼠心肌病理?yè)p傷減輕程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 檢測(cè)大鼠心肌組織病理形態(tài)（HE染色×200） 圖2 檢測(cè)大鼠心室組織纖維化程度（Mosson染色×400）

2.3 止麻消痰活血湯對(duì)大鼠心室纖維化的影響假手術(shù)組大鼠心室組織中幾乎無膠原纖維出現(xiàn)，纖維化癥狀未呈現(xiàn)；相比假手術(shù)組，模型組大鼠心室組織膠原纖維顯著增加，纖維化癥狀嚴(yán)重；相比模型組，止麻消痰活血湯低劑量、中劑量及高劑量組、地爾硫?組大鼠心室組織膠原纖維減少，纖維化減輕，且止麻消痰活血湯各組之間逐漸減輕，相比地爾硫?組，止麻消痰活血湯高劑量組大鼠心室組織膠原纖維減少及纖維化癥狀減輕程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

2.4 止麻消痰活血湯對(duì)大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α水平的影響相比假手術(shù)組，模型組大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α水平顯著升高（P<0.05）。相比模型組，止麻消痰活血湯低劑量、中劑量及高劑量組、地爾硫?組大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α 水平降低（P<0.05），且止麻消痰活血湯各組之間呈劑量依賴性，相比地爾硫?組，止麻消痰活血湯高劑量組大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 SD大鼠72只血清TGF-β1、IL-6、TNF-α水平/±s

注：TNF-α 為大鼠腫瘤壞死因子-α，IL-6 為大鼠白細(xì)胞介素-6，TGF-β1為大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1。①與假手術(shù)組比較，均P<0.001。②與模型組比較，均P<0.001。③與止麻消痰活血湯低劑量組比較，均P<0.001。④與止麻消痰活血湯中劑量組比較，均P<0.001。

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2.5 止麻消痰活血湯對(duì)大鼠心肌組織NRG-1/ErbB3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響相比假手術(shù)組，模型組大鼠心肌組織NRG-1/ErbB3 通路相關(guān)蛋白NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 顯著降低（P<0.05）。相比模型組，止麻消痰活血湯低劑量、中劑量及高劑量組、地爾硫?組大鼠心肌組織NRG-1/ErbB3通路相關(guān)蛋白NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 升高（P<0.05），且止麻消痰活血湯各組之間呈劑量依賴性，相比地爾硫?組，止麻消痰活血湯高劑量組大鼠心肌組織NRG-1/ErbB3 通路相關(guān)蛋白NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖3，表3。

表3 各組大鼠心肌組織NRG-1/ErbB3通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)/±s

表3 各組大鼠心肌組織NRG-1/ErbB3通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)/±s

注：NRG-1 為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1，GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，p-ErbB3 為磷酸化受體酪氨酸蛋白激酶3，ErbB3 為受體酪氨酸蛋白激酶。①與假手術(shù)比較，均P<0.001。②與模型組比較，均P<0.001。③與止麻消痰活血湯低劑量組比較，均P<0.001。④與止麻消痰活血湯中劑量組比較，均P<0.001。

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圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠心肌組織NRG-1/ErbB3通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

MI后心室重構(gòu)的病理機(jī)制復(fù)雜，其中心梗后心肌組織會(huì)出現(xiàn)持續(xù)的缺血缺氧，活性氧及自由基過量產(chǎn)生，引發(fā)致纖維化因子TGF-β1 及致炎因子TNF-α、IL-6 過量合成，引發(fā)炎癥及氧化應(yīng)激損傷，另外救治時(shí)，血流的再灌注可進(jìn)一步促使炎癥發(fā)展，加重心肌損傷及纖維化變性，是引發(fā)心室重構(gòu)的主要病理基礎(chǔ)［14-16］。本研究通過SD 大鼠結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支來制備MI 老年大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌纖維扭曲、斷裂，心肌細(xì)胞肥大、壞死，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，且膠原纖維顯著增多，纖維化變性癥狀嚴(yán)重，血清TGF-β1、IL-6及TNF-α水平、左心室質(zhì)量指數(shù)顯著升高，表明阻止冠狀動(dòng)脈血流可促使炎癥因子及致纖維化因子表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引發(fā)心肌損傷、纖維化變性及心肌肥大，最終造成心室病理性重構(gòu)，揭示模型建立成功。

MI作為中醫(yī)理論中胸痹心痛的一種，以溫通心陽(yáng)為基，配以行氣、活血、消痰，標(biāo)本兼治為主要治療方法，具有益氣、消痰、化痰、活血功效的中藥方劑可減輕再灌注損傷，改善MI 病人心功能［8-9，17］。止麻消痰活血湯主要由黃芪、半夏、膽南星、赤芍、桃仁、甘草等藥物組成，黃芪益氣健脾；半夏化痰除濕、消痞散結(jié)；膽南星清熱祛痰，息風(fēng)定驚；赤芍涼血清熱，止痛散瘀；桃仁活血祛瘀；甘草調(diào)和諸藥等，諸藥合用，可消痰扶正、活血益氣、祛痰化濁、化瘀通脈，可改善冠心病心絞痛病人血脂指標(biāo)，修復(fù)心室功能，有效緩解其臨床癥狀［10-11，18］，因而推測(cè)該方劑可改善MI后心室重構(gòu)癥狀。本研究顯示，采用止麻消痰活血湯干預(yù)MI老年大鼠，可緩解其病理?yè)p傷及纖維化變性癥狀，降低血清TGF-β1、IL-6 及TNF-α 水平、左心室質(zhì)量指數(shù)，且呈劑量依賴性，表明止麻消痰活血湯可抑制致纖維化及致炎因子表達(dá)，降低炎癥水平，緩解MI老年大鼠心肌損傷及病理性肥大癥狀，延緩其心肌纖維化變性與心室重構(gòu)。

NRG-1/ErbB3 是重要的心臟保護(hù)通路，NRG-1與廣泛分布于心肌細(xì)胞表面的ErbB3 結(jié)合后，可通過調(diào)控下游PI3K/AKT、ERK 等信號(hào)途徑傳導(dǎo)，減輕MI 后炎癥及氧化應(yīng)激，緩解其心肌肥大及病理?yè)p傷，延緩心室重塑，降低心臟衰竭發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)心臟功能［7，19-20］，本研究結(jié)果顯示，老年MI 大鼠心肌組織中NRG-1/ErbB3 通路相關(guān)蛋白NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 顯著降低，以止麻消痰活血湯治療后，NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 顯著升高，呈劑量依賴性，表明NRG-1/ErbB3 通路在老年MI 大鼠心室重塑過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，止麻消痰活血湯可上調(diào)NRG-1表達(dá)，增強(qiáng)ErbB3磷酸化，進(jìn)而保護(hù)心臟病理?yè)p傷，改善心室重構(gòu)。

綜上所述，止麻消痰活血湯可能通過激活NRG-1/ErbB3 信號(hào)通路，降低炎性因子及致纖維化因子表達(dá)，減輕MI 所致心肌損傷及纖維化變性，緩解心室重構(gòu)，保護(hù)心功能，為臨床改善MI預(yù)后，降低心室重構(gòu)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)提供了新參考，但本研究尚未通過促進(jìn)或抑制NRG-1/ErbB3信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，存在一定不足，還需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探討。