阿米卡星調控微小RNA-223對脂多糖誘導的肺泡上皮細胞凋亡以及腫瘤壞死因子α、白細胞介素6表達的影響

孫利平，宋亞玲，李春艷

作者單位：棗莊礦業集團中心醫院兒科，山東 棗莊 277000

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種常見的肺部疾病，表現為肺容積減少、順應性降低、通氣/血流量不平衡、急性和持續性肺部炎癥、彌漫性肺泡損傷，最終導致血氧不足和呼吸衰竭［1-2］。阿米卡星是一種常用的氨基糖苷類抗生素，其通過抑制蛋白質合成，破壞細菌細胞壁完整性，對革蘭陰性桿菌、青霉素耐藥金黃色葡萄球菌感染均具有較強的抗菌作用［3］。文獻資料顯示，阿米卡星和頭孢他啶的聯用可有效降低單獨用藥帶來的并發癥和不良反應，對社區獲得性肺炎病人療效顯著［4-5］。此外，阿米卡星和頭孢地嗪聯用還可明顯抑制肺炎克雷伯氏菌感染引起的胸腺細胞凋亡［6］。然而，阿米卡星對急性肺損傷是否具有保護作用尚未可知。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細胞外膜重要組成部分，其通過激活機體免疫細胞刺激宿主細胞分泌炎性細胞因子，參與機體炎癥反應。目前，LPS誘導的肺泡上皮細胞已被廣泛用于急性肺損傷機制研究［7-8］。本研究通過探討阿米卡星對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡、炎癥反應的影響，初步探索其可能分子機制，以期為阿米卡星在ALI中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料大鼠肺泡上皮細胞、Ham's F-12K培養液購于武漢普諾賽生命科技有限公司；脂多糖購于美國Sigma 公司；阿米卡星（海康朗生物科技有限公司，CAS 號37517-28-5，純度≥98%）；miR-223 模擬物（mimics）及其對照（miR-NC）、miR-223 抑制物（anti-miR-223）及其對照（anti-miR-NC）由上海生工公司提供；膜聯蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒、免疫沉淀裂解緩沖液、硝酸纖維素膜、二喹啉甲酸（Bicin?choninic acid，BCA）、Trizol 法試劑盒購于上海碧云天公司；兔源裂解的胱天蛋白酶3（cl-caspase3）抗體、胱天蛋白酶3 前體（pro-caspase3）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、山羊抗兔IgG 二抗購于上海艾博抗公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor ne?crosis factor α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于上海鈺博生物；PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Green Master Mix購于大連Takara公司。

1.2 細胞培養和實驗分組實驗于2020 年1—7 月完成，大鼠肺泡上皮細胞采用Ham's F-12K 培養液（添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗）于含95%空氣、5%二氧化碳的37 ℃恒溫細胞培養箱中培養。取對數期生長良好的細胞進行實驗，實驗分組如下：對照組（不作處理）、模型組（15 mg/L 的LPS處理細胞24 h）、實驗組（加入15 mg/L 的LPS+不同濃度的阿米卡星處理細胞24 h，實驗1組、實驗2組、實驗3組阿米卡星濃度分別為5μg/L、10μg/L、15μg/L）、anti-miR-NC 組（轉染微小RNA 陰性對照后用15 mg/L 的LPS 處理細胞24 h）、anti-miR-223 組（轉染微小RNA-223 抑制劑后用15 mg/L 的LPS 處理細胞24 h）、實驗3+miR-NC組（轉染微小RNA 陰性對照后進行15 mg/L的LPS和15μg/L的阿米卡星處理）、實驗3+miR-223 組（轉染微小RNA-223 激動劑后進行15 mg/L的LPS和15μg/L的阿米卡星處理）。

1.3 流式細胞術檢測細胞凋亡收集肺泡上皮細胞，采用PBS液洗滌細胞2次。用1×結合緩沖液調整為密度為1×106個/毫升的單細胞懸液。取100μL細胞懸液，按照細胞凋亡檢測試劑盒步驟分別加入An?nexin V-FITC和PI，室溫避光孵育15 min，補加400μL的1×結合緩沖液，混勻后進行流式細胞術檢測。

1.4 Western blotting 檢測cl-caspase3、pro-cas?pase3 表達采用含有蛋白酶抑制劑的預冷免疫沉淀裂解緩沖液分離總蛋白，BCA 法進行蛋白定量。取30μg 蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的細胞蛋白轉移到硝酸纖維素膜。5%脫脂乳4 ℃封閉膜過夜，然后分別與稀釋的一抗、二抗室溫孵育2 h。GAPDH 作為內部對照，增強型化學發光試劑進行顯色，QuantityOne 軟件分析目的蛋白表達水平。

1.5 ELISA 試劑盒檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6水平收集各組細胞培養液上清，用DMEM 培養液配制標準品。參照ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6的含量。

1.6 RT-qPCR 檢測miR-223 表達Trizol 法 提 取細胞總RNA，微量分光光度計測定RNA濃度。利用PrimeScript RT 試劑盒合成單鏈互補DNA，-20 ℃保存備用。利用SYBR Green Master Mix 試劑進行qP?CR檢測，2-ΔΔCt法分析miR-223的表達水平。

miR-223：正向引物5′-AGCTGGTGTTGTGAAT?CAGGCCG-3′，反 向 引 物 5′-TGGTGTCGTG?GAGTCG-3′。U6：正向引物5′-CTCGCTTCGGCAG?CACATATACT-3′，反 向 引 物5′-ACGCTTCAC?GAATTTGCGTGTC-3′。

1.7 統計學方法采用SPSS 18.0 軟件進行統計分析，每組設置3 個平行實驗，重復3 次，數據以xˉ±s表示。采用t檢驗評估兩組間差異；采用單因素方差分析評估多組間差異，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 阿米卡星對LPS 作用肺泡上皮細胞凋亡的影響與對照組比較，模型組肺泡上皮細胞凋亡率、cl-caspase3 蛋白表達增加，pro-caspase3 蛋白表達降低；與模型組比較，實驗組肺泡上皮細胞凋亡率、clcaspase3 蛋白表達降低，pro-caspase3 蛋白表達升高（P<0.05）。見圖1，表1。

圖1 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細胞凋亡（A）及cl-caspase3、pro-caspase3蛋白（B）表達的影響

表1 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細胞凋亡的影響/±s

表1 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細胞凋亡的影響/±s

注：cl-caspase3 為兔源裂解的半胱天冬酶-3，pro-caspase3 為半胱天冬酶-3酶原。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。

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2.2 阿米卡星對LPS作用肺泡上皮細胞中TNF-α、IL-6 表達的影響與對照組比較，模型組肺泡上皮細胞培養液上清中TNF-α、IL-6 含量顯著升高；與模型組比較，實驗組肺泡上皮細胞培養液上清中TNFα、IL-6含量顯著降低（P<0.05）。見表2。

表2 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細胞中TNF-α、IL-6表達的影響/（ng/L，±s）

表2 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細胞中TNF-α、IL-6表達的影響/（ng/L，±s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細胞介素6。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。

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2.3 阿米卡星對LPS 作用肺泡上皮細胞中miR-223 表達的影響與對照組1.00±0.06 比較，模型組肺泡上皮細胞中miR-223 表達顯著升高（P<0.05）；與模型組5.35±0.14 比較，實驗組肺泡上皮細胞中miR-223 表達（實驗1 組4.26±0.14，實驗2 組3.54±0.12，實驗3 組1.89±0.10）顯著降低（P<0.05）。對照組、模型組、實驗組肺泡上皮細胞中miR-223表達比較，差異有統計學意義（F=2 078.82，P<0.001）。

2.4 抑制miR-223 對LPS 作用肺泡上皮細胞凋亡及TNF-α、IL-6 表達的影響與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-223 組肺泡上皮細胞miR-223 和cl-cas?pase3 蛋白表達、細胞凋亡率顯著降低，pro-caspase3蛋白表達顯著增加，細胞培養液上清中TNF-α、IL-6含量顯著降低（P<0.05）。見圖2，表3。

圖2 抑制miR-223對脂多糖作用肺泡上皮細胞凋亡（2A）及cl-caspase3、pro-caspase3蛋白（2B）表達的影響 圖3 miR-223可逆轉阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細胞凋亡（3A）及cl-caspase3、pro-caspase3蛋白（3B）表達的影響

表3 抑制miR-223對脂多糖作用肺泡上皮細胞凋亡及TNF-α、IL-6表達的影響/±s

注：anti-miR-NC 為miR 陰性對照，anti-miR-223 為miR-223 抑制劑，miR-223 為微小RNA-223，cl-caspase3 為兔源裂解的半胱天冬酶-3，procaspase3為半胱天冬酶-3酶原，TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細胞介素6。

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2.5 miR-223 可逆轉阿米卡星對LPS 作用肺泡上皮細胞凋亡及TNF-α、IL-6 表達的影響與實驗3+miR-NC 組比較，實驗3+miR-223 組肺泡上皮細胞miR-223 表達、cl-caspase3 蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高，pro-caspase3 蛋白表達顯著降低，細胞培養液上清中TNF-α、IL-6 含量顯著升高（P<0.05）。見圖3，表4。

表4 miR-223可逆轉阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細胞凋亡及TNF-α、IL-6表達的影響/±s

表4 miR-223可逆轉阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細胞凋亡及TNF-α、IL-6表達的影響/±s

注：miR-223 為微小RNA-223，cl-caspase3 為兔源裂解的半胱天冬酶-3，pro-caspase3 為半胱天冬酶-3 酶原，TNF-α 為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細胞介素6。

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3 討論

既往研究顯示，霧化吸入阿米卡星脂質體混懸液除用于治療禽結核菌引起的難治性非結核分枝桿菌肺病外，還可治療慢性銅綠假單胞菌引起的呼吸機相關性肺炎，提高病人細菌清除率、治愈率，降低促炎因子分泌［9-11］。本研究顯示LPS 誘導后肺泡上皮細胞凋亡率、cl-caspase3 蛋白表達顯著升高，pro-caspase3蛋白表達顯著降低，阿米卡星干預呈劑量依賴性地抑制cl-caspase3 蛋白表達，促進pro-cas?pase3 蛋白表達，減輕LPS 誘導的肺泡上皮細胞凋亡。當機體受到LPS 刺激時，會釋放一系列促炎細胞因子如TNF-α，而TNF-α 也可激活中性粒細胞促進IL-6 等炎性因子的釋放，進一步擴大炎癥反應［12］。本研究顯示LPS 誘導后TNF-α、IL-6 分泌量顯著升高，而阿米卡星干預可顯著抑制TNF-α、IL-6分泌。此外，隨著阿米卡星濃度逐漸增加，其對TNF-α、IL-6 分泌抑制作用逐漸增強。以上研究說明阿米卡星能夠改善LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應，進而起到肺泡上皮細胞損傷保護作用。

miR-223 是一種造血細胞特異性微小RNA（mi?croRNA，miRNA），它參與調節自然免疫穩態和結核分枝桿菌誘導的應激反應，與NF-κb 依賴性巨噬細胞分化、炎癥、感染和腫瘤進展有關［13-14］。近年研究顯示，miR-223 在重癥肺炎病兒血漿中表達顯著增加，是重癥肺炎早期診斷、判斷炎癥嚴重程度的重要指標［15-16］。在內毒素血癥小鼠肺組織中miR-223也呈高表達［17］。此外，有研究指出miR-223 從中性粒細胞向肺上皮細胞的細胞間轉移可能通過抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 表達而減輕ALI［18-19］。本研究發現LPS 誘導后肺泡上皮細胞miR-223 表達顯著增加，而阿米卡星干預顯著降低miR-223 的表達水平，于是推測阿米卡星對LPS 誘導的肺泡上皮細胞損傷的保護作用可能與調控miR-223 表達有關。進一步研究顯示，抑制miR-223 表達可抑制clcaspase3 蛋白表達，促進pro-caspase3 蛋白表達，抑制TNF-α、IL-6 分泌，減輕LPS 誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應，與阿米卡星對肺泡上皮細胞損傷的保護作用一致。深入研究發現，上調miR-223 表達還可逆轉阿米卡星對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥損傷的保護作用。以上研究提示下調miR-223 表達可能是阿米卡星發揮肺泡上皮細胞保護作用的重要機制。

綜上，本研究發現阿米卡星顯著降低了LPS 誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應，其機制可能與下調miR-223 表達有關。這為阿米卡星在ALI 中的應用奠定了實驗基礎。