柴胡皂苷A通過抑制內質網應激信號通路減輕烏頭堿中毒大鼠腦組織細胞凋亡的機制分析

李華，徐鵬，趙艷，雷艷青

作者單位：湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院急診科，湖北 襄陽 441000

烏頭堿是存在于川烏、草烏、附子等植物中的主要成分，民間常用于治療風濕麻痹等疾病［1］，但也因炮制不當食用出現中毒甚至死亡。烏頭堿目前還未發現特效解藥［2］。柴胡皂苷A是由傘形科植物柴胡的根莖提取、提純制成的粉末，具有抗炎、抗病毒的作用，此外還有鎮靜和抗驚厥等諸多藥理學作用［3］。動物研究顯示柴胡皂苷A具有抑制海馬炎癥反應以及提高大鼠認知功能相關蛋白水平的作用［4］，但柴胡皂苷A是否對烏頭堿引起的腦組織損傷有保護作用，尚未有研究報道。本研究旨在探索柴胡皂苷A對烏頭堿中毒大鼠腦組織的影響及其可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器Saikosaponin A（中國上海源葉生物科技有限公司），Aconitine、ECL 試劑盒（中國上海經科化學科技有限公司），兔抗鼠Bcl 相關X 蛋白（Bax）抗體（中國上海優予生物科技有限公司），兔抗鼠B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶3（Cas?pase-3）、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）、葡萄糖調節蛋白78（GRP78）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（中國上海恒斐生物科技有限公司），TUNEL 試劑盒（中國江蘇凱基生物技術股份有限公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海遠慕生物科技有限公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）elisa 試劑盒（中國上海信帆生物科技有限公司），白細胞介素-6（IL-6）elisa 試劑盒（中國上海歌凡生物科技有限公司），冷凍離心機3K15（美國Sigma 公司），正置熒光顯微鏡FM-51D（中國上海繪統光學儀器有限公司），全自動輪盤式切片機（LEICA）。

1.2 實驗動物及分組本研究自2018 年10 月至2019 年7 月，選取購自武漢大學中南醫院動物實驗中心SPF 級健康雄性16～20 周齡SD 大鼠100 只［武漢大學中南醫院動物實驗中心，許可證號SYXK（鄂）2015-0025］，體質量范圍為250～300 g。購回飼養1 周，溫度20～25 ℃，空氣濕度50%～55%，人工光照，光照12 h、黑暗12 h，所有大鼠全天飲水自由。將100 只SD 大鼠隨機均分為對照組、模型組、干預組1、干預組2、干預組3，每組各20 只。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.3 模型制備及給藥處理參考文獻［5］中的染毒方法進行烏頭堿中毒大鼠模型制備，模型組與干預組大鼠均進行烏頭堿（20μg/kg）尾靜脈注射，觀察各組大鼠心電圖情況，待大鼠心律失常3 min后進行藥物干預，干預組1、干預組2、干預組3 分別注射不同劑量的柴胡皂苷A（5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg），模型組與對照組注射等劑量生理鹽水。各組分別于干預后12 h、24 h時隨機選取10只大鼠進行麻醉處死，分離腦組織。

1.4 HE 組織染色與TUNEL 法檢測組織凋亡分別于藥物干預后12 h、24 h，采用1%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，分離腦組織，一部分固定于4%多聚甲醛，常規石蠟包埋、切片、染色詳細步驟參考文獻［6］。一部分腦組織用于TUNEL 細胞凋亡情況，組織固定、包埋、切片方法與HE 組織染色相同。各組所有片子在400 倍視野下選取海馬區不重疊視野4 個進行觀察。陽性判定標準：細胞核呈現出棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞，記為凋亡的海馬神經細胞，經Image-Pro Plus 6.0軟件對高倍鏡下的陽性細胞數目進行統計，神經細胞凋亡率=（陽性細胞個數/有核細胞總數）×100%。

1.5 氧化應激指標及炎癥反應指標檢測將各組織大鼠完整腦組織取出，加入組織細胞裂解液、蛋白酶抑制劑，研磨成組織勻漿，3 000 r/min，離心20 min，取上清液，采用聯免疫法檢測各組大鼠腦組織中MDA、TNF-α、IL-6水平，SOD 活性，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測參照蛋白質提取試劑盒說明對各組大鼠腦組織蛋白進行提取，Bradford 調整蛋白濃度，依次經過SDS-PAGE電泳、電轉膜，密封2 h，加入兔抗鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2、CHOP、GRP78、GAPDH 一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜再用TBST 漂洗40 min，加入HRP 標記的二抗（1∶500）孵育1 h，參照ECL 試劑盒操作說明進行觀察膜上蛋白條帶，收集影像。

1.7 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件，文中數據以±s表示，符合正態分布且方差齊的數據組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗，反之采用非參數Mann-WhitneyU檢驗，檢驗水準α=0.05；文中劑量效應分析時，除去對照組，把模型組（藥物干預劑量為0）與3個不同干預劑量處理的干預組進行單因素方差分析，然后再進行LSD-t檢驗，當方差分析和兩兩比較LSD-t均P<0.05后，說明有劑量反應性。

2 結果

2.1 柴胡皂苷A 對烏頭堿中毒大鼠腦組織的影響將各組大鼠麻醉后，取完整的腦組織進行HE染色觀察腦組織情況，結果顯示對照組大鼠腦組織神經元細胞形態的正常，呈現出圓形或者橢圓形，核膜完整，無病變細胞。模型組大鼠腦組織神經元細胞呈現出胞核固縮、細胞腫脹、神經元變性及壞死癥狀，且排列稀疏。干預組1、干預組2、干預組3大鼠神經細胞的病變情況逐漸減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織情況（HE染色×400） 圖2 烏頭堿中毒大鼠腦組織凋亡情況（TUNEL檢測×400）

2.2 柴胡皂苷A對烏頭堿中毒大鼠腦組織氧化應激的影響將各組大鼠的腦組織取出并勻漿離心，留取上清液用于檢測腦組織SOD 活性及MDA 含量。結果顯示，與對照組相比，模型組、干預組大鼠12 h、24 h SOD活性降低，MDA含量升高（P<0.05）；與模型組相比，干預組大鼠12 h、24 h SOD 活性升高，MDA含量降低，均差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠腦組織SOD、MDA含量比較/±s

表1 各組大鼠腦組織SOD、MDA含量比較/±s

注：MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶。①與對照組同時點比較，P<0.05。②與模型組同時點比較，P<0.05。③與干預組1同時點比較，P<0.05。④與干預組2同時點比較，P<0.05。

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2.3 柴胡皂苷A 對促烏頭堿中毒大鼠腦組織炎癥反應的影響將各組大鼠的腦組織取出并勻漿離心，留取上清液用于檢測腦組織TNF-α、IL-6 含量。結果顯示，與對照組相比，模型組、干預組大鼠12 h、24 h 的TNF-α、IL-6 含量均升高（P<0.05）；與模型組相比，干預組大鼠12 h、24 h的TNF-α、IL-6含量均降低（P<0.05），見表2。

表2 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量比較/（ng/L，/±s）

表2 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量比較/（ng/L，/±s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白細胞介素-6。①與對照組同時點比較，P<0.05。②與模型組同時點比較，P<0.05。③與干預組1同時點比較，P<0.05。④與干預組2同時點比較，P<0.05。

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2.4 柴胡皂苷A 對促烏頭堿中毒大鼠腦組織凋亡的影響TUNEL 檢測結果顯示，與對照組相比，模型組、干預組大鼠12 h、24 h的腦組織細胞凋亡率均升高，均差異有統計學意義（P<0.05）；與模型組相比，干預組大鼠12 h、24 h的腦組織細胞凋亡率均降低（P<0.05）。Western blotting 檢測結果顯示，與對照組相比，模型組、干預組大鼠12 h、24 h 的腦組織Bcl-2 蛋白水平均降低，Bax 蛋白水平均升高（P<0.05）；與模型組相比，干預組大鼠12 h、24 h 的腦組織Bcl-2 蛋白水平均升高，Bax 蛋白水平均降低（P<0.05）。見圖2，3；表3。

表3 各組大鼠腦組織細胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平比較/±s

表3 各組大鼠腦組織細胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平比較/±s

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl相關X蛋白。①與對照組同時點比較，P<0.05。②與模型組同時點比較，P<0.05。③與干預組1同時點比較，P<0.05。④與干預組2同時點比較，P<0.05。

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2.5 柴胡皂苷A 對烏頭堿中毒大鼠腦組織內質網應激信號通路的影響Western blotting 檢測結果顯示，與對照組相比，模型組、干預組大鼠12 h、24 h的腦組織CHOP、GRP78蛋白水平均升高（P<0.05）；與模型組相比，干預組大鼠12 h、24 h 的腦組織CHOP、GRP78蛋白水平均降低（P<0.05）。見圖4，表4。

表4 各組大鼠腦組織CHOP、GRP78蛋白水平比較/±s

表4 各組大鼠腦組織CHOP、GRP78蛋白水平比較/±s

注：CHOP為CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白，GRP78為葡萄糖調節蛋白78。①與對照組同時點比較，P<0.05。②與模型組同時點比較，P<0.05。

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圖4 各組大鼠腦組織CHOP、GRP78蛋白凝膠成像結果

3 討論

烏頭堿對機體各個器官均有一定的毒性作用，其中以神經系統與心血管系統受損最嚴重。2%烏頭堿溶液處理大鼠腦片皮質20 min，可使神經細胞全部死亡［7］。柴胡皂苷A 具有較好的抗炎、調節免疫［8］、抵抗肝纖維化［9］以及鎮靜、抗驚厥作用，同時還能夠改善腦損傷大鼠認知功能與神經功能［10］。本研究發現柴胡皂苷A可以改善烏頭堿中毒大鼠腦組織病理情況，延緩中毒大鼠腦組織細胞凋亡，表明柴胡皂苷A對烏頭堿中毒大鼠也有腦組織保護作用。

圖3 各組大鼠腦組織Bax、Bcl-2蛋白凝膠成像結果

細胞凋亡也叫作細胞程序性死亡，引起細胞凋亡的因素眾多，包括創傷、缺血缺氧、毒物刺激、感染等。凋亡也是多種基因共同作用結果，主要涉及兩條途徑，一條是細胞膜上的死亡受體激活半胱氨酸蛋白激酶，引起細胞凋亡途徑活化；另一條是通過細胞質線粒體途徑釋放各種細胞凋亡因子，激活半胱氨酸蛋白激酶活性，經過系列的信號傳導，使胞內蛋白質降解，促使細胞凋亡［11］。本研究結果顯示，柴胡皂苷A 可以升高Bcl 蛋白水平，降低Bax 蛋白水平。Bcl-2 是線粒體途徑凋亡通路中的重要成員，其含量增加可以抑制細胞凋亡，Bax 有促進細胞凋亡的作用，兩者比值變化可直接反映組織凋亡情況［12-13］。由此表明，柴胡皂苷A 可以通過調節烏頭堿中毒大鼠腦組織中Bax、Bcl 蛋白水平，來降低腦組織細胞凋亡率。

烏頭堿中毒大鼠腦組織出現凋亡，暗示腦組織出現損傷，氧化應激、炎癥反應也參與腦組織損傷進程［14］。本研究結果顯示，柴胡皂苷A 可以降低烏頭堿中毒大鼠腦組織中MDA、TNF-α、IL-6 水平，增加SOD活性。MDA 是脂質過氧化的終端產物，其水平變化可以直接顯示組織損傷嚴重程度，SOD 是機體清除自由基的主要物質［15-16］。TNF-α、IL-6 屬于促炎因子之一，機體內部的TNF-α、IL-6 主要是由單核細胞、巨噬細胞產生，腦內小膠質細胞、星形膠質細胞、神經細胞以及血管內皮細胞也可以分泌。朱雙龍等［17］研究顯示柴胡皂苷A可以通過調節急性脊髓損傷早期炎性因子水平來減輕繼發性免疫炎癥反應，Chen 等［18］研究也表明柴胡皂苷A 可以抑制香煙誘導的氧化應激及炎癥反應。而本研究表明，柴胡皂苷A可以通過降低烏頭堿中毒大鼠腦組織氧化應激與炎癥反應。

內質網應激是指由多種因素導致錯誤折疊蛋白、未折疊蛋白于內質網腔累積，最終引起內質網功能行使受阻。在內質網應激早期，細胞通過啟動未折疊蛋白反應特異性信號系統，促進GRP78 上調，與內質網中錯誤折疊蛋白、未折疊蛋白結合，糾正蛋白正確構象［19］。但在內質網應激過久時，CHOP 會大量表達，啟動CHOP 介導的細胞凋亡。減輕或抑制內質網應激，可能預防細胞凋亡。本研究結果顯示，柴胡皂苷A 可以降低烏頭堿中毒大鼠CHOP、GRP78 蛋白水平，有研究顯示右美托咪定可以通過抑制內質網氧化應激來減輕大鼠腦損傷［20］，本研究結果與其有相似之處，表明柴胡皂苷A 可以通過降低烏頭堿中毒大鼠腦組織內質網應激反應，從而降低細胞凋亡。

綜上所述，柴胡皂苷A 可以降低烏頭堿中毒大鼠腦組織氧化應激、炎癥反應以及內質網應激反應，降低腦組織細胞凋亡率，實現對腦組織的保護作用。本研究通過大鼠模型進行探討，而在臨床上是否存在相似變化以及柴胡皂苷A 的臨床使用劑量，還需要進一步研究。