黑老虎根提取物調控微小RNA-193對肝星狀細胞HSC-T6增殖凋亡的影響

范玉梅，趙明，趙媛，劉俊英

作者單位：周口市中心醫院消化科，河南 周口 466330

肝纖維化（liver fibrosis）是多種原因引起的慢性肝損傷所致的病理改變，其最終可致肝硬化、肝功能紊亂，主要表現為細胞外基質（ECM）的過度沉積［1］。研究表明肝星狀細胞（HSCs）的激活在肝纖維化發展過程中起關鍵作用，HSCs活化可導致細胞外基質的增加，這是肝纖維化形成并最終導致肝硬化、肝功能衰竭的主要原因；因此抑制HSCs 活化、增殖，進而減少ECM 合成是目前阻斷、逆轉肝纖維化的重要策略［2］。研究顯示多種中藥可發揮抗肝纖維化作用，通過直接作用于HSCs實現［3］。黑老虎根是五味子科五味子屬植物的干燥根，其具有抗氧化、抗炎等作用［4］。有研究表明黑老虎根提取物可減少脂質在肝臟的沉積、減輕過氧化損傷，對大鼠非酒精性脂肪肝具有調節脂質和保護肝臟的作用［5］。黑老虎根提取物對肝星狀細胞（HSC-T6）細胞的增殖具有抑制作用［6］。以上研究表明黑老虎根提取物可能具有抗纖維化作用。miR-193 在實驗性肝損傷大鼠［7］、肝癌［8］中低表達，其是否參與對HSCT6 細胞的調控還未見研究。因此，本研究通過研究黑老虎根提取物對HSC-T6 增殖、凋亡的影響以及miR-193 過表達在其中的作用，為黑老虎根提取物的臨床應用以及miR-193的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料研究起止時間為2018年10月至2019年12 月。大鼠HSC-T6 細胞（CL-0116）購自武漢普諾賽，黑老虎根提取物購自西安金綠，細胞周期檢測試劑盒（E-CK-A351）購自武漢Elabsscience 公司，細胞計數（CCK-8）試劑盒（C0039）、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（P0012）、凋亡試劑盒（C1062L）、定量即時聚合酶鏈鎖反應（RT-qPCR）所用試劑盒（D7260）購自上海碧云天。細胞增殖核抗原（Ki67）（ab16667）、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved caspase-3）（ab32042）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（ab9485）、二抗（ab6728）購自abcam公司。

1.2 細胞培養與分組HSC-T6細胞培養液選擇RP?MI-1640（含10%小牛血清），分別用1.5 mg/L、3.0 mg/L、6.0 mg/L黑老虎根提取物處理對數生長期HSC-T6細胞，記為實驗1、2、3組；另選取未加黑老虎根提取物的HSC-T6細胞作為對照組。將miR-NC、miR-193轉染至HSC-T6細胞中，記為miR-NC組、miR-193組；將anti-miR-NC、anti-miR-193 分別轉染至HSC-T6 細胞中再用6.0 mg/L黑老虎根提取物處理，記為實驗3+an?ti-miR-NC組、實驗3+anti-miR-193組。

1.3 流式細胞儀檢測HSC-T6 細胞周期收集培養48 h 的“1.2”中的各組HSC-T6 細胞（2×105個），磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后離心去上清，乙醇（70%）固定（-20 ℃，4 h），離心（350g，5 min），PBS洗滌，加入碘化啶（PI）（濃度為50 mg/L）與RNaseA（孵育15 min），上機測定，分析各組HSC-T6 細胞G0-G1期、S期、G2-M期細胞比例。

1.4 CCK-8 檢測HSC-T6 細胞存活率收集培養48 h 的“1.2”中各組HSC-T6 細胞，加入10μL CCK-8試劑/孔，孵育2 h 后，酶標儀測定各組HSC-T6 細胞吸光度（A）值（490 nm 處）。細胞存活率（%）=A實驗組/A對照組×100%。實驗重復3次。

1.5 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測HSCT6 細胞Ki67、Cleaved caspase-3 蛋白表達提取HSC-T6 細胞總蛋白并對提取蛋白進行定量（BCA法）。蛋白（50 μL）行SDS-PAGE 電泳，濕法轉移到PVDF 膜，封閉1 h；加入Ki67、Cleaved caspase-3、GAPDH（內參）抗體，Ki67、Cleaved caspase-3 稀釋比為1∶1 000，GAPDH 稀釋比為1∶5 000；過夜后添加二抗培養1 h，稀釋比為1∶5 000，測定Ki67、Cleaved caspase-3蛋白灰度值。實驗重復3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡收集培養48 h 的“1.2”中各組HSC-T6細胞，PBS漂洗2次，Annexin VFITC 試劑盒處理HSC-T6 細胞，避光孵育10 min，上機檢測HSC-T6細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-193表達水平收集培養48 h的“1.2”中各組HSC-T6細胞，提取總RNA，經反轉錄成互補DNA（cDNA），進行PCR擴增。miR-193 以U6 為內參，miR-193：正向引物AACTGGCCTACAAAGTC-3， 反 向 引 物 GTG?CAGGGTCCGAGGT。U6：正向引物GCTTCGGCAG?CACATATACTAAAAT，反 向 引 物 CGCTTCAC?GAATTTGCGTGTCAT。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.8 統計學方法采用SPSS 20.0 軟件進行此研究數據分析，計量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黑老虎根提取物對HSC-T6 細胞細胞周期分布與對照組、實驗1 組相比，實驗2、實驗3 組G0-G1期細胞比例升高，S期細胞比例降低，且呈濃度依賴性（均P<0.05），而各組G2-M 期細胞所占比例差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6細胞周期的影響/（%，±s）

表1 黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6細胞周期的影響/（%，±s）

注：①與對照組相比，P<0.05。②與實驗1 組相比，P<0.05。③與實驗2組相比，P<0.05。

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2.2 黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6 細胞活性的影響CCK-8 及Western blotting 檢測結果顯示，與對照組和實驗1 組相比，實驗2、3 組細胞存活率降低，Ki67 表達水平降低，且呈濃度依賴性（P<0.05），見圖1，表2。

圖1 黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6細胞Ki67蛋白表達的影響

表2 黑老虎根提取物對纖維化肝細胞細胞活性及Ki67的影響/±s

表2 黑老虎根提取物對纖維化肝細胞細胞活性及Ki67的影響/±s

注：Ki67為細胞增殖核抗原。①與對照組相比，P<0.05。②與實驗1組相比，P<0.05。③與實驗2組相比，P<0.05。

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2.3 黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6 凋亡的影響流式細胞術及Western blotting 檢測結果顯示，與對照組和實驗1 組相比，實驗2、3 組細胞凋亡率升高，Cleaved caspase-3 表達水平升高，且呈濃度依賴性（P<0.05），見表3。

表3 黑老虎提取物對纖維化肝細胞凋亡的影響/±s

表3 黑老虎提取物對纖維化肝細胞凋亡的影響/±s

注：Cleaved caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3。①與對照組相比，P<0.05。②與實驗1組相比，P<0.05。③與實驗2組相比，P<0.05。

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2.4 黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6 中miR-193 表達的影響RT-qPCR 檢測結果顯示，與對照組（0.92±0.04）和實驗1 組（0.93±0.05）相比，實驗2、3 組miR-193 表達水平（1.65±0.05、2.69±0.07）升高，且呈濃度依賴性（F=727.26，P<0.001）。

2.5 過表達miR-193對肝星狀細胞HSC-T6細胞周期、細胞活性及凋亡的影響與miR-NC 組相比，miR-193 組miR-193 表達水平升高，G0-G1 期細胞比例升高，S 期細胞比例降低（均P<0.05）；細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，Ki67表達水平降低，Cleaved caspase-3表達水平升高（均P<0.05），見圖2，表4。

圖2 miR-193對肝星狀細胞HSC-T6細胞凋亡（2A）、細胞活性（2B）的影響 圖3 抑制miR-193可逆轉黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6細胞凋亡（3A）及凋亡相關蛋白表達（3B）的影響

表4 過表達miR-193對肝星狀細胞HSC-T6細胞周期、細胞活性及凋亡的影響/±s

表4 過表達miR-193對肝星狀細胞HSC-T6細胞周期、細胞活性及凋亡的影響/±s

注：Ki67為細胞增殖核抗原，Cleaved caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3。

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2.6 抑制miR-193 表達逆轉了黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6 細胞周期、細胞活性及凋亡的影響與實驗3+anti-miR-NC 組相比，實驗3+antimiR-193 組細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，G0-G1期細胞所占比例降低，S期細胞所占比例升高（均P<0.05）；Ki67表達水平升高，Cleaved caspase-3表達水平降低（均P<0.05），見圖3，表5。

表5 抑制miR-193可逆轉黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6細胞周期、細胞活性及凋亡的影響/±s

表5 抑制miR-193可逆轉黑老虎根提取物對肝星狀細胞HSC-T6細胞周期、細胞活性及凋亡的影響/±s

注：Ki67為細胞增殖核抗原，Cleaved caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3。

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3 討論

肝纖維化是肝臟慢性炎癥進一步向肝硬化、肝癌發展的重要環節；而肝纖維化的形成是由多細胞，多因子共同參與的復雜病理過程［9-11］。HSCs 是肝臟細胞外基質的重要來源，其可合成并分泌細胞外基質，并促進肝細胞的正常增殖，肝星狀細胞激活是肝纖維化形成的重要原因之一［12］，因此，抗纖維化治療可以HSCs 為靶向細胞，研究顯示，垂盆草總黃酮可通過Smads通路對HSCs細胞活化抑制發揮抗肝纖維化作用［13］；GATA6 抑制HSC 活化抗肝纖維化［14］。以上研究均佐證HSCs在抗肝纖維化中的作用。

近年來研究表明中藥能夠多途徑，多靶點作用于HSCs，誘導HSCs 凋亡、減少活化的HSCs，從而發揮抗肝纖維化作用［3］，如烏蘭十三味湯可調節HSCs活化抑制肝纖維化［15］。黑老虎根來源于植物冷飯團，具有抗炎、鎮痛作用，已有研究表明黑老虎根提取物具有保護肝臟的作用［7］。此外，來自黑老虎根的二苯并環辛二烯木脂素和羊毛甾烷衍生物對叔丁基過氧化氫誘導的原代大鼠肝細胞損傷也具有保護作用［16］。本研究用不同濃度的黑老虎根提取物處理肝星狀細胞HSC-T6，研究黑老虎根提取物對HSC-T6 增殖、凋亡的影響，結果顯示，3.0 mg/L、6.0 mg/L黑老虎根提取物處理的HSC-T6中，G0-G1期細胞比例較未經處理HSC-T6細胞高，而S期細胞比例則降低，提示3.0 mg/L、6.0 mg/L 濃度的黑老虎根提取物可促使HSC-T6 細胞S 期阻滯，通過調控HSC-T6 細胞生長周期控制細胞增殖進程。研究顯示HSC-T6 細胞存活率、Ki67 表達降低，而凋亡率、cleaved caspase-3 升高，提示3.0 mg/L、6.0 mg/L 濃度的黑老虎根提取物發揮抑制HSC-T6 細胞增殖、促進HSC-T6 細胞凋亡。而1.5 mg/L 黑老虎根提取物處理的HSC-T6 中各指標均差異無統計學意義。說明濃度過低的黑老虎根提取物對HSC-T6 細胞存活、凋亡無作用。

研究表明miRNA 可調控HSCs 的活化、增殖、凋亡等，在肝纖維化發生發展中起著重要的作用［17］，其中miR-193 在肝纖維化過程中表達水平降低［18］。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）是HSCs 活化的標志性分子，研究報道miR-193 能抑制活化型HSCs 中肝纖維化相關基因α-SMA 的表達［19］。miR-193 是轉化生長因子Beta（TGF-β）依賴性調節網絡的一部分，可控制肝纖維化中的細胞外基質基因［20］。miR-193 在實驗性肝損傷大鼠中低表達，miR-193過表達可降低肝損傷大鼠α-SMA 蛋白表達［8］。本實驗結果顯示，miR-193過表達可升高G0-G1期細胞比例，并降低S期細胞比例；同時降低HSC-T6細胞存活率、Ki67表達，并升高細胞凋亡率與cleaved caspase-3。說明過表達miR-193可調控HSC-T6細胞周期、抑制HSC-T6細胞增殖、促進細胞凋亡。且本研究還發現3.0 mg/L、6.0 mg/L黑老虎根提取物處理的HSC-T6細胞中miR-193表達水升高；而抑制miR-193表達逆轉了黑老虎根提取物對HSC-T6細胞抑增殖、促凋亡作用。

綜上所述，黑老虎根提取物可抑制HSC-T6 細胞惡性化增殖，可能與黑老虎根提取物上調miR-193 表達相關；可為肝纖維化的治療提供新方法和新靶點。