丹酚酸A對脂多糖誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究

馮靜，李莉

作者單位：1海口市人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海南 海口 570208；2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液凈化科，海南 海口 570100

腎小球系膜細(xì)胞在臨床上又被稱為球內(nèi)系膜細(xì)胞、血管系膜細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、深部內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管細(xì)胞，位于腎小球毛細(xì)血管袢間，屬于一種腎小球固有細(xì)胞，其細(xì)胞形狀不規(guī)則，具有產(chǎn)生細(xì)胞因子、分泌細(xì)胞基質(zhì)、吞噬或者清除大分子物質(zhì)、支撐腎小球毛細(xì)血管叢的功能［1］。在機(jī)體處于正常生理狀態(tài)下時(shí)，腎小球細(xì)胞細(xì)胞增殖、凋亡處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體受到外界因素刺激會導(dǎo)致增殖、凋亡失衡，過度增殖，而腎小球系膜細(xì)胞過度增殖是多種進(jìn)行性腎小球疾病的共同病理基礎(chǔ)，抑制腎小球系膜細(xì)胞過度增殖可在一定程度上抑制疾病進(jìn)一步進(jìn)展［2-3］。丹酚酸A 屬于丹參的主要水溶性有效成分之一，目前已有研究證實(shí)其具有心肌缺血保護(hù)、抗氧化、抗肝纖維化、抗血栓、作用于細(xì)胞增殖凋亡等作用［4］。基于此背景，在本研究中分析丹酚酸A 對LPS誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞凋亡的作用及作用機(jī)制，為臨床上抑制腎小球系膜細(xì)胞過度增殖的研究提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料研究細(xì)胞：人腎小球系膜細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

主要試劑及儀器：脂多糖（LPS）（德國德賽公司，批號60067113/1）；胰酶（武漢益普生物科技有限公司，批號CK-E30628）；PI染液（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，批號JKMK1509A）；小鼠抗大鼠磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）抗體（深圳市豪地華拓生物科技有限公司，批號PL0402037）；兔抗大鼠蛋白激酶B（AKT）抗體（武漢純度生物科技有限公司，批號CDB101529A-KT）；小鼠抗大鼠哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體（上海鈺博生物科技有限公司，批號YB831）；兔抗人胱天蛋白酶-3（caspase-3）抗體（武漢益普生物科技有限公司，批號ATA25878）；兔抗人B 細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體（武漢菲恩生物科技有限公司，批號FNab10410）；兔抗人B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體（武漢菲恩生物科技有限公司，批號FNab00840）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司，型號NU4950E）；流式細(xì)胞儀［默瑞（上海）生物科技有限公司，型號CytoFLEX S］；熒光顯微鏡（上海土森視覺科技有限公司，型號DM2500）。

藥物來源：丹酚酸A（四川省維克奇生物科技有限公司，批號96574-01-5，批次XY0519，純度>98%）。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 本研究起止時(shí)間為2018年5月至2019年5月。購買華拓生物生產(chǎn)的HGMC人腎小球系膜細(xì)胞（貨號HT-X1 990），使用含10%胎牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)液在含5%二氧化碳、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，第2天換液，當(dāng)所培養(yǎng)的細(xì)胞融合率范圍為80%～90%時(shí)做傳代處理。將細(xì)胞隨機(jī)分為A 組（不做任何處理的人腎小球系膜細(xì)胞）、B 組（LPS+人腎小球系膜細(xì)胞）、C 組（LPS+人腎小球系膜細(xì)胞+低劑量丹酚酸A）、D 組（LPS+人腎小球系膜細(xì)胞+中劑量丹酚酸A）、E 組（LPS+人腎小球系膜細(xì)胞+高劑量丹酚酸A）。

丹酚酸A 處理：使用5%乙醇做丹酚酸A 溶解，使用0.2 mol/L 的PS 溶液過濾除菌，制備為10 mg/L的低劑量丹酚酸A、20 mg/L 的中劑量丹酚酸A、40 mg/L的高劑量丹酚酸A3個(gè)濃度備用。

細(xì)胞種板后24 h 更換為無血清培養(yǎng)液，A 組細(xì)胞不添加任何藥物，B 組、C 組、D 組、E 組細(xì)胞培養(yǎng)基中均加入10 mg/L LPS 培養(yǎng)，1 h 后C 組、D 組、E 組分別在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入低劑量丹酚酸A（10 mg/L）、中劑量丹酚酸A（20 mg/L）、高劑量丹酚酸A（40 mg/L）做細(xì)胞培養(yǎng)24 h后做后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖檢測 使用MTT 比色法檢測細(xì)胞細(xì)胞增殖情況，在細(xì)胞培養(yǎng)后將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×104個(gè)/毫升，接種于96 孔板中，將200 μL 細(xì)胞懸液加入至每孔中，在37 ℃、5%二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入10μL 的MTT 試劑繼續(xù)孵育4 h，采用酶標(biāo)儀測定波長為570 mm 的細(xì)胞組光密度（optical density，OD）值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（細(xì)胞組OD值/參照組OD值）×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡率，在熒光顯微鏡下對細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，經(jīng)洗滌、DAPI 染色封片后的細(xì)胞核分別呈現(xiàn)為陽性（綠色熒光）和陰性（藍(lán)色熒光），之后計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。

1.2.4細(xì)胞周期檢測 采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶中（每瓶6×105個(gè)），使用胰酶消化后收集細(xì)胞，利用4 ℃預(yù)冷的70%乙醇做細(xì)胞重懸固定處理，在4 ℃下孵育過夜，1 000 r/min 離心處理，處理5 min 后將上清吸除，使用PBS重復(fù)洗滌2次，將RNA酶加入至500μL 的1×Buffer 重懸細(xì)胞，使得終濃度為10 g/L，之后在37 ℃環(huán)境下孵育，孵育0.5 h，避光，之后將終濃度為50 m/L 的PI 染液，在4 ℃環(huán)境下反應(yīng)，反應(yīng)0.5 h，避光，之后將PBS 加入至2 mL，最后采用Dx?FLEX流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.2.5細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR 信號通路指標(biāo)表達(dá)量檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達(dá)量，將細(xì)胞行10 000g離心處理10 min，對上清液進(jìn)行提取后，BCA進(jìn)行蛋白定量檢測，在2×SDS（十二烷基硫酸鈉）凝膠緩沖液中加入50μg蛋白，在100 ℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉(zhuǎn)膜，取膜，4 ℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時(shí)間為1 h，將一抗使用0.05%～0.1%TBST（等滲鹽溶液加三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）給予稀釋（p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、cas?pase-3、Bax、Bcl-2 一抗為1∶1 000），4 ℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST 洗膜，3 次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.1%TBST稀釋（1∶10 000），搖動孵育時(shí)間為1 h，再次采用TBST 連續(xù)洗膜3 次，處理時(shí)間為5 min，DAB顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料采用±s描述，多組間比較采用單因素方差分析。兩兩組間比較采用HSD-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸A 對細(xì)胞增殖、凋亡的影響與A 組相比，B 組、C 組、D 組、E 組細(xì)胞增殖率升高；與B 組相比，C 組、D 組、E 組細(xì)胞增殖率降低；與C 組相比，D組、E組細(xì)胞增殖率降低；與D組相比，E組細(xì)胞增殖率降低；與A組相比，B組細(xì)胞凋亡率降低；與A組相比，C 組、D 組、E 組細(xì)胞凋亡率升高；與B 組相比，C組、D組、E組細(xì)胞凋亡率升高；與C組相比，D組、E組細(xì)胞凋亡率升高；與D組相比，E組細(xì)胞凋亡率升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見圖1，表1。

圖1 腎小球系膜細(xì)胞凋亡圖（TUNEL染色×40）

表1 丹酚酸A對人腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡的影響/（%，±s）

表1 丹酚酸A對人腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡的影響/（%，±s）

注：①與A 組相比，P<0.05。②與B 組相比，P<0.05。③與C 組相比，P<0.05。④與D組相比，P<0.05。

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2.2 丹酚酸A對細(xì)胞周期的影響與A組相比，B組G0/G1期細(xì)胞分布率降低，S期、G2/M期細(xì)胞分布率升高；與A組相比，C組、D組、E組組G0/G1期細(xì)胞分布率升高，S期、G2/M期細(xì)胞分布率降低；與B組相比，C組、D組、E組G0/G1期細(xì)胞分布率升高，S期、G2/M期細(xì)胞分布率降低；與C組相比，D組、E組G0/G1期細(xì)胞分布率升高，S期、G2/M期細(xì)胞分布率降低；與D組相比，E組G0/G1期細(xì)胞分布率升高，S期、G2/M期細(xì)胞分布率降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見表2。

表2 丹酚酸A對人腎小球系膜細(xì)胞周期的影響/（%，±s）

表2 丹酚酸A對人腎小球系膜細(xì)胞周期的影響/（%，±s）

注：①與A 組相比，P<0.05。②與B 組相比，P<0.05。③與C 組相比，P<0.05。④與D組相比，P<0.05。

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2.3 丹酚酸A 對細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR 信號通路的影響與A 組相比，B 組、C 組、D 組、E 組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、caspase-3、Bcl-2 表達(dá)量升高，Bax表達(dá)量降低；與B 組相比，C 組、D 組、E 組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、caspase-3、Bcl-2 表達(dá)量降低，Bax 表達(dá)量升高；與C 組相比，D 組、E 組p-PI3K、p-AKT、pmTOR、caspase-3、Bcl-2 表達(dá)量降低，Bax 表達(dá)量升高；與D 組相比，E 組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、cas?pase-3、Bcl-2 表達(dá)量降低，Bax 表達(dá)量升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見圖2，表3。

表3 丹酚酸A對人腎小球系膜細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響/±s

表3 丹酚酸A對人腎小球系膜細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響/±s

注：①與A組相比，P<0.05。②與B組相比，P<0.05。③與C組相比，P<0.05。④與D組相比，P<0.05。

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圖2 丹酚酸A對人腎小球系膜細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白質(zhì)印跡圖

3 討論

腎小球系膜細(xì)胞屬于一種血管平滑肌樣細(xì)胞，具有多種生理功能，如調(diào)節(jié)腎血流量、吞噬進(jìn)入至腎小球的大分子物質(zhì)、合成系膜基質(zhì)等，其既是眾多病理因子所作用的靶細(xì)胞，又是腎小球中活躍度最高的一類細(xì)胞，在人機(jī)體內(nèi)腎小球炎癥性疾病的組織病理學(xué)改變均會導(dǎo)致腎小球細(xì)胞細(xì)胞過度增殖［5-6］。腎小球系膜細(xì)胞異常增殖是多種腎小球疾病的病變基礎(chǔ)，異常增殖促使過量的細(xì)胞外基質(zhì)生成、聚集，可引發(fā)腎臟纖維化、腎小球硬化、終末期腎功能衰竭等多種疾病的發(fā)生，抑制其過度增殖對抑制腎臟疾病進(jìn)展具有重要的作用［7］。基于此背景，本研究為尋找有效抑制腎小球系膜細(xì)胞過度增殖的干預(yù)藥物，使用LPS 誘導(dǎo)，運(yùn)用丹酚酸A 干預(yù)，分析丹酚酸A 對LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響，并深入研究其作用機(jī)制，以抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，抑制腎臟疾病進(jìn)展。

丹參屬于我國的一種傳統(tǒng)中藥，為唇形科植物，其具有抗氧化、擴(kuò)張血管、促進(jìn)血液春煥、抗凝血、抗腫瘤、增加心肌供血、改變血液黏滯性、抗菌、消炎等藥理作用，丹參的化學(xué)成分主要包括水溶性丹酚酸類和脂溶性丹參酮類等，其中丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB 等為脂溶性成分，丹酚酸A、丹酚酸B、原兒茶酸、原兒茶醛等為水溶性成分［8-9］。丹酚酸A 作為丹參的水溶性成分，屬于內(nèi)含多個(gè)酚羥基的有機(jī)酸類化合物，目前有較多研究分析其藥理作用，研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A具有較為廣泛的藥理活性，包括降血脂、改變血液流變學(xué)、擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、抑制脂質(zhì)過氧化、改變增殖、凋亡失衡等［10-12］。崔勤濤等［13］在其研究中發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A 可經(jīng)激活A(yù)KT/mTOR/4EBP1信號通路緩解脂多糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。李偉文等［14］在其研究中認(rèn)為，丹酚酸A 可改變脂多糖誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬和細(xì)胞損傷。上述研究均證實(shí)丹酚酸A 與細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS干預(yù)后的腎小球系膜細(xì)胞增殖率較高，凋亡率較低，細(xì)胞周期分布異常，說明在LPS的刺激下導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡失衡，經(jīng)丹酚酸A 干預(yù)后，腎小球系膜細(xì)胞增殖率顯著降低，而凋亡率升高，周期分布改變，且呈劑量依賴，此結(jié)果提示著，丹酚酸A 可抑制LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜增殖，促進(jìn)凋亡，阻滯細(xì)胞周期，最終抑制疾病進(jìn)一步進(jìn)展。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/mTOR 信號通路與細(xì)胞增長生長、調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［15］。近年來隨著臨床上對腎臟疾病的逐漸深入研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/mTOR 信號通路異常參與多種腎臟疾病的發(fā)生進(jìn)展，在機(jī)體受到LPS 的刺激下，細(xì)胞內(nèi)的PI3K 被活化，進(jìn)而激活蛋白激酶B、磷酸肌醇依賴性酶，增加I 型膠原蛋白等指標(biāo)異常表達(dá)，最終誘發(fā)腎小球系膜出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，最終損傷系膜細(xì)胞，破壞其增殖、凋亡之間的動態(tài)平衡，導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞異常增殖，進(jìn)一步加重多種腎臟疾病進(jìn)展［16-18］。目前臨床上已有試驗(yàn)證實(shí)，PI3K/AKT/mTOR 信號通路與腎小球系膜細(xì)胞病變相關(guān)，岳媛等［19］在其研究中認(rèn)為，烏索酸可經(jīng)抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路修復(fù)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞損傷狀況，李豫江等［20］同樣在其研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)來氟米特干預(yù)可誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與PI3K/Akt/mTOR 信號通路失活相關(guān)。張春江等［21］在其研究中證實(shí)，PI3K/Akt/mTOR信號通路與腎小球系膜細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)。基于此研究背景，本研究擬認(rèn)為PI3K/Akt/mTOR 信號通路為丹酚酸A改變LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制，結(jié)果顯示，經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后PI3K/Akt/mTOR信號通路失活，此結(jié)果提示著丹酚酸A 可能經(jīng)作用于PI3K/Akt/mTOR 信號通路改變LPS 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞生物學(xué)行為。

雖然本研究首次證實(shí)丹酚酸A 經(jīng)作用于PI3K/Akt/mTOR信號通路改變LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞生物學(xué)行為，但目前臨床上并未有研究分析丹酚酸A的上述作用，因此本研究上述研究結(jié)果還需后續(xù)研究進(jìn)一步分析驗(yàn)證，以期望為臨床上研究提供參考。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸A可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞凋亡，抑制增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，其作用機(jī)制可能與促使PI3K/AKT/mTOR信號通路失活，調(diào)控caspase-3、Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白相關(guān)。