高通量測(cè)序技術(shù)分析鴨皮中耐熱菌群

海丹，喬明武，宋蓮軍，沈玥，孟靜南，黃現(xiàn)青

摘? 要：鴨皮作為肉制品中常用的添加原料，其微生物在不同熱殺菌處理狀態(tài)下的多樣性研究非常重要。將鴨皮分別在60、70、80、90、100、110、120 ℃條件下熱處理后25 ℃恒溫放置1 周，通過高通量測(cè)序分析鴨皮的微生物多樣性情況。結(jié)果表明：60 ℃熱處理的鴨皮中主要菌屬為假單胞菌屬（33.52%）和不動(dòng)桿菌屬（18.55%），70 ℃熱處理的鴨皮中主要菌屬為不動(dòng)桿菌屬（18.46%）、狹義厭氧梭菌屬18（12.41%）、變形桿菌屬（11.04%）、假單胞菌屬（10.17%）、狹義厭氧梭菌屬7（8.62%），80、90 ℃熱處理的鴨皮中優(yōu)勢(shì)菌屬為狹義厭氧梭菌屬18，相對(duì)豐度分別為63.04%和84.11%，100 ℃熱處理組優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬（49.50%）、狹義厭氧梭菌屬18（29.19%）和厭氧桿菌屬（17.20%），110 ℃熱處理組優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬（99.23%），120 ℃熱處理組優(yōu)勢(shì)菌屬為狹義厭氧梭菌屬18（52.41%）、芽孢桿菌屬（33.07%）和狹義厭氧梭菌屬7（12.23%）;樣品聚類和β-多樣性分析表明，溫度對(duì)鴨皮中的細(xì)菌群落組成和豐度差異影響較大。

關(guān)鍵詞：鴨皮;細(xì)菌多樣性;高通量測(cè)序;熱處理溫度;優(yōu)勢(shì)菌群

Analysis of Heat Resistant Bacteria in Duck Skin by High Throughput Sequencing

HAI Dan1，2， QIAO Mingwu1，2， SONG Lianjun1，2， SHEN Yue1，2， MENG Jingnan1， HUANG Xianqing1，2，3，4，*

（1.College of Food Science and Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou? ?450002， China; 2.Henan Engineering Technology Research Center of Food Processing and Circulation Safety Control， Zhengzhou? ?450002， China; 3.Henan Technology Innovation Center of Meat Processing and Research， Zhengzhou? ?450002， China; 4.Henan Engineering Research Center of Intelligent Meat Segmentation and Bioconversion， Zhengzhou? ?450002， China）

Abstract： As duck skin is commonly used a raw material for meat products， studying the microbial diversity in duck skin under different thermal sterilization conditions is vital. In the present study， duck skin was treated at 60， 70， 80， 90， 100， 110 or 120 ℃ and then stored at a constant temperature of 25 ℃ for one week. The microbial diversity of duck skin was investigated by high-throughput sequencing. Analysis of operational taxonomic units （OTUs） showed that the main bacterial genera in duck skin treated at 60 ℃ were Pseudomonas （33.52%） and Acinetobacter （18.55%）; and the main bacterial genera in duck skin treated at 70 ℃were Acinetobacter （18.46%）， Clostridium sensu stricto-18 （12.41%）， Proteus （11.04%） and Pseudomonas （10.17%）， and Clostridium-sensu-stricto-7 （8.62%）. Clostridium-sensu-stricto-18 （63.04% and 84.11% in relative abundance） were found to be dominant in duck skin treated at 80 and 90 ℃; Bacillus （49.50%）， Clostridium sensu-stricto-18 （29.19%） and Anaerosalibacter （17.20%） were dominant in duck skin treated at 100 ℃; the dominant bacteria in duck skin treated at 110 ℃ were Bacillus （99.23%）; the dominant bacteria in duck skin treated at 120 ℃ were Clostridium sensu stricto-18 （52.41%）， Bacillus （33.07%） and Clostridium sensu stricto-7 （12.23%）. Sample clustering and beta diversity analysis showed that temperature had a great influence on the differences in the bacterial community composition and abundance in duck skin.

Keywords： duck skin; bacterial diversity; high throughput sequencing; heat treatment temperature; dominant microflora

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220324-024

中圖分類號(hào)：TS251.92? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ?文章編號(hào)：

引文格式：

海丹， 喬明武， 宋蓮軍， 等. 高通量測(cè)序技術(shù)分析鴨皮中耐熱菌群[J]. 肉類研究， 2022， 36（5）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220324-024.? ? http：//www.rlyj.net.cn

HAI Dan， QIAO Mingwu， SONG Lianjun， et al. Analysis of heat resistant bacteria in duck skin by high throughput sequencing[J]. Meat Research， 2022， 36（5）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220324-024.? ? http：//www.rlyj.net.cn

我國(guó)是肉制品生產(chǎn)大國(guó)，擁有悠久的肉制品加工歷史[1-3]。近些年來，隨著食品工業(yè)的迅速發(fā)展，家禽類成為僅次于豬肉的第二大類消費(fèi)肉制品[4]。家禽主要有雞、鴨、鵝等，其中以雞鴨肉制品最為常見。鴨皮是肉鴨在屠宰過程的副產(chǎn)品，因其富含多種營(yíng)養(yǎng)成分且可以改變?nèi)庵破返纳珴伞①|(zhì)地、口感等特性[5]而被應(yīng)用于肉制品中[6]。然而，與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)對(duì)家禽副產(chǎn)品的利用程度和方式比較單一，不同規(guī)模的企業(yè)對(duì)家禽副產(chǎn)品的利用程度和深度不盡相同[7-10]。我國(guó)對(duì)副產(chǎn)品的利用更多集中在血、毛、頭、爪、內(nèi)臟、骨架等[11]，早期企業(yè)對(duì)于豬皮、鴨皮、雞皮的利用都集中在膠原蛋白的提取[12-13]，近年來，食品企業(yè)和相關(guān)學(xué)者加強(qiáng)了對(duì)畜禽皮的綜合開發(fā)利用，為開發(fā)新的、多樣化的火腿腸，迎合越來越多口味挑剔消費(fèi)者的需要，伍佰鑫等[14]從湖南長(zhǎng)沙某鴨肉加工廠采購(gòu)宰后48 h的新鮮鴨胸肉和鴨皮，預(yù)先磨碎并均質(zhì)化，添加到火腿腸中，發(fā)現(xiàn)鴨皮添加量為30%或40%的鴨火腿品質(zhì)較優(yōu)，有效改善了適口性。聶曉開[15]研究北京烤鴨的風(fēng)味形成原理和西式火腿的成型工藝，使用鴨脯肉作為原料，在單獨(dú)烤制鴨皮形成烤鴨風(fēng)味的基礎(chǔ)上，制備壓縮火腿。在我國(guó)，禽類的屠宰加工過程包括：掛禽→電擊暈→宰殺→瀝血→浸燙→脫毛→胴體體表檢查→摘嗉→凈毛→去頭→開膛→切爪→轉(zhuǎn)掛→掏臟→內(nèi)臟檢驗(yàn)→臟體分離（副產(chǎn)品）→副產(chǎn)品加工→預(yù)冷前檢驗(yàn)→胴體高壓沖洗→預(yù)冷減菌→預(yù)冷后檢驗(yàn)→分割[16]。預(yù)冷減菌階段是禽肉屠宰加工中微生物的關(guān)鍵控制點(diǎn)之一[16]，工廠生產(chǎn)過程中經(jīng)預(yù)冷后能控制鴨肉等產(chǎn)品的微生物生長(zhǎng)，在預(yù)冷階段鴨皮原料的微生物數(shù)量與后期鴨皮在熱處理階段的初始菌數(shù)量密切相關(guān)，降低鴨皮中所含的微生物種類及數(shù)量對(duì)肉制品的安全控制影響重大。

目前，熱處理仍是食品工業(yè)中常用的殺菌方法，根據(jù)其溫度的不同，可以分為低、中、高溫肉制品，其殺菌溫度范圍為60～120 ℃，溫度不同，殺菌效果不同。細(xì)菌種類不同，對(duì)熱的耐受程度也不同，導(dǎo)致不同熱處理的肉制品腐敗菌群也可能不同。高通量測(cè)序技術(shù)中因包含了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）這一步驟，導(dǎo)致不能區(qū)分活/死細(xì)胞的DNA，從而導(dǎo)致不真實(shí)的多樣性或過高估計(jì)活細(xì)胞的數(shù)量。而疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）因其具有疊氮基團(tuán)，在光照下能與死細(xì)胞的DNA分子發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，從而抑制死細(xì)胞DNA分子擴(kuò)增，且PMA不能進(jìn)入活細(xì)胞，與活細(xì)胞DNA發(fā)生共價(jià)交聯(lián)。基于這一優(yōu)點(diǎn)，PMA分子被用于處理鴨皮在經(jīng)過熱殺菌后死亡細(xì)菌的DNA，從而得到鴨皮中仍存活的細(xì)菌群落組成。這對(duì)添加熱殺菌鴨皮的肉制品殺菌工藝的選擇、可能致腐微生物的預(yù)防及預(yù)測(cè)有重要指導(dǎo)意義。因此，本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同熱殺菌后鴨皮耐熱微生物菌落情況進(jìn)行分析研究，為企業(yè)安全使用鴨皮原料提供數(shù)據(jù)支撐。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料與試劑

新鮮的鴨皮取自河南安陽(yáng)某肉制品企業(yè)，選用北京鴨。

NaCl? ?天津市江天化工技術(shù)有限公司;一步式DNA提取試劑盒? ?北京天恩澤基因科技有限公司;E.Z.N.A.?細(xì)菌基因組提取試劑盒? ?美國(guó)Omega Bio-Tek公司;熱啟動(dòng)高保真DNA聚合酶試劑盒? ?北京全式金生物技術(shù)有限公司;EX Taq酶? ?日本TaKaRa公司;PMA? ?美國(guó)Biotium公司;二甲基亞砜? ?河南比根生物科技有限公司。

1.2? ?儀器與設(shè)備

CFX 96熒光定量PCR儀? ?美國(guó)Bio-Rad公司;FXB303-2電熱恒溫培養(yǎng)箱? ?上海樹立儀器儀表有限公司;NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)、1300系列II級(jí)A2型生物安全柜? ?賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司;5430高速冷凍離心機(jī)? ?德國(guó)Eppendorf公司;ABI 9700 PCR儀? ?美國(guó)GeneAmp公司;DYY-6C電泳儀? ?北京六一儀器廠;Gel DocIt TS3紫外凝膠成像系統(tǒng)? ?美國(guó)UVP公司;SX-500全自動(dòng)蒸汽滅菌鍋? ?日本Tomy公司;400CC拍擊式均質(zhì)機(jī)? ?法國(guó)BagMixer公司;Qubit 2.0 Flurometer熒光光度計(jì)? ?上海Life Technologies公司;2100生物分析儀? ?美國(guó)安捷倫科技有限公司;MiSeq System高通量測(cè)序儀? ?美國(guó)Illumina公司。

1.3? ?方法

1.3.1? ?樣品制備及分組

通過無菌操作對(duì)鴨皮取樣，從25 kg鴨皮中隨機(jī)選擇24 份鴨皮樣品（每份25 g），分別置于無菌袋中并用橡皮帶密封，以未經(jīng)熱處理（25 ℃）的樣品為對(duì)照組，其余樣品平分為7 組，每組3 個(gè)平行，分別置于60、70、80、90、100、110、120 ℃中進(jìn)行水浴熱殺菌，使用針刺式肉品中心溫度計(jì)（量程50～300 ℃）直接刺在鴨皮上，當(dāng)樣品的中心溫度達(dá)到對(duì)應(yīng)溫度時(shí)，計(jì)時(shí)10 min。熱處理后的樣品放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱1 周，以實(shí)現(xiàn)活菌富集。樣品培養(yǎng)1 周后取出，向樣品中加入225 mL無菌生理鹽水，并在拍打式均質(zhì)器中勻化120 s，取20 mL勻漿物17 226×g離心10 min收集細(xì)菌，棄去上清液，將收集的細(xì)菌溶解在500 μL無菌生理鹽水中備用。

1.3.2? ?PMA處理

將1 mg PMA溶于200 μL體積分?jǐn)?shù)20%二甲基亞砜中，制備5 μg/μL的儲(chǔ)備溶液，并在-20 ℃下避光保存。使用時(shí)，將PMA儲(chǔ)備溶液稀釋10 倍，用作PMA工作溶液。使用透明的1.5 mL離心管，將10 μL PMA工作溶液加入到500 μL細(xì)菌溶液中，至終質(zhì)量濃度為10 μg/mL。在黑暗中孵育5 min后，使用650 W鹵素光源將樣品曝光5 min。樣品管放置在離光源約20 cm處并水平放置在冰上（以避免過度加熱）。偶爾進(jìn)行搖動(dòng)以保證光照均勻。在光誘導(dǎo)交聯(lián)后，17 226×g離心10 min收集細(xì)菌。

1.3.3? ?細(xì)菌基因組DNA提取

熱殺菌組和未加熱組的鴨皮分別裝入無菌均質(zhì)袋中，再加入225 mL滅菌生理鹽水后在拍打式均質(zhì)器中勻化120 s，取20 mL勻漿物17 226×g離心10 min收集細(xì)菌。然后使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。

1.3.4? ?16S rDNA文庫(kù)制備

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品是否有降解和雜質(zhì)，通過超微量分光光度計(jì)初步檢測(cè)DNA樣品純度，熒光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品濃度，檢驗(yàn)合格的DNA（A260 nm/A230 nm大于1.2，質(zhì)量濃度20 ng/μL）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR實(shí)驗(yàn)采用熱啟動(dòng)高保真DNA聚合酶，20 μL反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、上游引物（5 μmol/L）0.8 μL、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL、FastPfu 聚合酶0.4 μL、牛血清白蛋白0.2 μL、模板DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增使用的引物為上游引物：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）、下游引物：805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。為確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性，使用EX Taq酶。擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行富集，然后加入1 μL特異Index序列，建庫(kù)流程如圖1所示。完整的文庫(kù)結(jié)構(gòu)包含P5、i5Index（Index2）、i7Index（Index1）和P7，其中P5、P7接頭位于文庫(kù)兩端，Index是用于文庫(kù)混合測(cè)序時(shí)區(qū)分不同樣本的標(biāo)簽，是測(cè)序文庫(kù)的唯一識(shí)別碼。

1.3.5? ?庫(kù)檢及測(cè)序

文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用熒光光度計(jì)進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1 ng/μL，隨后使用生物分析儀對(duì)文庫(kù)的插入片段進(jìn)行檢測(cè)，所插入片段符合預(yù)期后，使用熒光定量PCR儀及相關(guān)的熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。檢測(cè)合格的文庫(kù)采用HiSeq進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序模式、通量及質(zhì)量選擇PE250模式。檢測(cè)合格的文庫(kù)，采用高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3.6? ?數(shù)據(jù)過濾

測(cè)序得到的某些原始序列會(huì)含有測(cè)序接頭序列及低質(zhì)量序列，為了保證信息分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量，對(duì)原始序列進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的Clean Reads，用于后續(xù)分析。

1.3.7? ?序列拼接

對(duì)過濾后的序列，采用PEAR序列拼接算法將雙末端測(cè)序序列根據(jù)末尾的重疊情況合并成一條序列，再進(jìn)行下一步分析。PEAR程序可以合并來自可變長(zhǎng)度靶片段的原始Illumina雙端Reads。該程序評(píng)估了所有可能的雙端Reads重疊，不需要靶片段大小作為輸入，而且還通過統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)減少假陽(yáng)性概率。在模擬數(shù)據(jù)和實(shí)際數(shù)據(jù)上的測(cè)試顯示，PEAR可以高度準(zhǔn)確地對(duì)雙端Reads進(jìn)行合并。

1.3.8? ?數(shù)據(jù)處理

測(cè)序得到的序列，使用Flash和Trimmomatic軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括進(jìn)行質(zhì)量控制、去除前后引物和條形碼得到有效序列，然后使用Uparse軟件（vsesion 7.0，http：//drive5.com/uparse/）對(duì)有效序列在97%水平上進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類[17]。在QIIME平臺(tái)（http：//qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html），采用RDP classifier（version 2.2，http：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析[18]，分別在門、屬水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成，與細(xì)菌16S rDNA數(shù)據(jù)庫(kù)Greengene（Release 13.5，http：//greengenes.secondgenome.com/）對(duì)比[19]。利用α-多樣性和β-多樣性對(duì)樣品菌群進(jìn)行評(píng)價(jià)[20]。選取Shannon、Simpson、Ace、Chao 1指數(shù)和覆蓋率等指標(biāo)進(jìn)行α-多樣性分析，其中，Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)反映群落豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落多樣性。基于Bray-Curtis計(jì)算方法，采用主成分分析（principal components analysis，PCA）法和非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析法進(jìn)行β-多樣性分析。Heatmap圖利用R語言Vegan算法計(jì)算得到，以顏色梯度表征二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)大小，并呈現(xiàn)群落物種組成信息[21]，每種處理3 個(gè)平行。通過SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異顯著性分析。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同熱殺菌處理鴨皮DNA序列長(zhǎng)度分析

通過16S rDNA高通量測(cè)序，8 組樣本、24 份樣品總共得到1 572 454 條優(yōu)質(zhì)序列。對(duì)所有樣品的優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由表1可知，序列長(zhǎng)度多集中于430～450 bp，符合理論值。

2.2? ?不同熱處理?xiàng)l件下鴨皮表面微生物α-多樣性分析

由表2可知：不同熱處理溫度對(duì)鴨皮中細(xì)菌多樣性的影響較大，8 組樣本覆蓋率均達(dá)到99.9%以上，且不存在顯著性差異，這表明在當(dāng)前測(cè)序量下能較好反映樣本細(xì)菌群落的豐富度和多樣性;Chao 1指數(shù)和Ace指數(shù)越高表明群落豐富度越高，60 ℃條件下熱處理的樣品具有最高的細(xì)菌群落豐富度，但與對(duì)照組和70 ℃處理的樣品之間不存在顯著性差異;Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低。110 ℃條件下熱處理的樣品具有最低的Shannon指數(shù)和最高的Simpson指數(shù)，表明鴨皮中細(xì)菌群落的多樣性最低。α-多樣性分析結(jié)果顯示，60 ℃熱處理的鴨皮樣品中觀測(cè)到的物種數(shù)超過對(duì)照組，但不存在顯著性差異，110 ℃熱處理的鴨皮樣品中觀測(cè)到物種最少，但與120 ℃處理的樣品不存在顯著性差異。

2.3? ?不同熱處理?xiàng)l件下鴨皮表面微生物物種組成分析

由圖2可知，在熱處理的鴨皮樣品中發(fā)現(xiàn)的菌門絕大多數(shù)均為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。對(duì)照組的主要菌門為變形菌門（63.71%）和厚壁菌門（30.17%）;60 ℃熱處理組與對(duì)照組相比，變形菌門具有更高的相對(duì)豐度，高達(dá)75.92%，厚壁菌門的相對(duì)豐度為22.32%，與對(duì)照組相比略有下降;而70 ℃處理組與對(duì)照組相比，變形菌門的相對(duì)豐度下降，厚壁菌門的相對(duì)豐度上升，分別為53.71%和40.75%;當(dāng)熱處理溫度大于70 ℃后，厚壁菌門成為最主要的菌門，80、90、100、110、120 ℃熱處理組相對(duì)豐度分別為97.32%、99.24%、97.86%、99.93%、99.97%）。

由圖3可知，當(dāng)熱處理溫度低于80 ℃時(shí)，樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬呈現(xiàn)一種較均勻的狀態(tài)，沒有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌屬，均由幾種菌屬共同組成。如對(duì)照組中，優(yōu)勢(shì)菌屬有假單胞菌屬（Pseudomonas）（21.94%）、變形桿菌屬（Proteus）（20.99%），其次是漫游球菌屬（Vogococcus）（11.59%）;60 ℃處理組樣品的主要菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）（33.52%）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）（18.55%），其次還有低豐度的變形桿菌屬（5.71%）和狹厭氧梭菌屬7（Clostridium sensu stricto 7）（6.32%）;70 ℃處理組樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬為不動(dòng)桿菌屬（18.46%）、狹義的厭氧梭菌屬18（Clostridium sensu stricto 18）（12.41%）、變形桿菌屬（11.04%）、假單胞菌屬（10.17%）、狹義的厭氧梭菌屬7（8.62%）;80 ℃和90 ℃處理組的優(yōu)勢(shì)菌屬為狹義厭氧梭菌屬18，相對(duì)豐度分別為63.04%和84.11%;100 ℃處理組的優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）（49.50%）、狹義厭氧梭菌屬18（29.19%）和厭氧桿菌屬（Anaerosalibacter）（17.20%）;110 ℃處理組的優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬（99.23%）;120 ℃處理組的優(yōu)勢(shì)菌屬為狹義厭氧梭菌屬18（52.41%）、芽孢桿菌屬（33.07%）和狹義厭氧梭菌屬7（12.23%）。總體來說，對(duì)照組及熱處理溫度低于80 ℃時(shí)，樣品中的主要菌屬較多樣，且沒有一種絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的菌屬;當(dāng)熱處理溫度≥80 ℃后，樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬開始傾向于產(chǎn)芽孢的菌屬，其中狹義厭氧梭菌屬18和芽孢桿菌屬最為突出。另外，厭氧桿菌屬是厭氧梭菌屬（Clostridium）的一個(gè)新屬，關(guān)于它的臨床研究尚較少。

2.4? ?不同熱處理?xiàng)l件下鴨皮表面微生物β-多樣性分析

為評(píng)估鴨皮的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與熱處理溫度之間的關(guān)系，采用PCA和NMDS多元統(tǒng)計(jì)方法分析8 組熱處理的鴨皮基于屬水平的群落結(jié)構(gòu)差異。由圖4～5可知，前2 個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為89.94%，8 個(gè)熱處理組的鴨皮樣品主要分為2 組，其中對(duì)照組和60、70 ℃熱處理的鴨皮樣品聚集在一起，這表明60、70 ℃熱處理組的處理效果差別不大，80、90、100、110、120 ℃熱處理的樣品聚集在一起。

2.5? ?不同熱處理?xiàng)l件下鴨皮表面微生物的聚類分析

對(duì)樣品中相對(duì)豐度前20的菌屬進(jìn)行聚類繪制熱圖。由圖6可知，對(duì)照組與60、70 ℃處理組樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬存在大部分交疊，表明這3 組鴨皮樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)基本相似。而80、90、100、110、120 ℃處理組的優(yōu)勢(shì)菌屬也存在交疊，主要集中在狹義厭氧梭菌18和芽孢桿菌屬2 種菌屬，這表明高于80 ℃熱處理的鴨皮中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的相似性。

3? ?討? 論

本研究針對(duì)熱處理溫度對(duì)鴨皮中細(xì)菌多樣性的影響研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組（25 ℃）相比，60、70 ℃熱處理對(duì)鴨皮微生物多樣性的影響較小，有研究表明，肉類產(chǎn)品熱加工過程中復(fù)雜介質(zhì)的物理和化學(xué)成分對(duì)微生物的殺傷力有影響，其中脂肪對(duì)菌株的耐熱性起重要作用[23]。也有研究表明，低熔點(diǎn)脂肪在高于其熔點(diǎn)的溫度下由固相快速轉(zhuǎn)變?yōu)橐合啵诖似陂g它能吸收相當(dāng)多的熱能，利用這種相變特性提高了加熱過程中益生菌的存活率[24]，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致，因此鴨皮所含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[22]在60、70 ℃熱殺菌條件下對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用，不能有效降低鴨皮的細(xì)菌多樣性。大多數(shù)食品加工通常在80～100 ℃的溫度下對(duì)成分進(jìn)行熱處理，保持5～15 min[25]。在此過程中，大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)形式的微生物被滅活，但是不足以殺死細(xì)菌內(nèi)生孢子[26]，因此本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)熱處理溫度≥80 ℃時(shí)，產(chǎn)芽孢的菌屬開始成為優(yōu)勢(shì)菌屬。一般來說，食物中的孢子在110～130 ℃濕熱處理20～40 min可以滅活，有時(shí)對(duì)于高酸性或冷藏的食品，80～100 ℃下處理10 min也足以使孢子失活[27-28]。這也解釋了鴨皮在加熱到110～120 ℃時(shí)仍有許多細(xì)菌能夠繼續(xù)存活下來。盡管更高溫度的熱處理可有效滅活孢子，但也會(huì)對(duì)熱敏感食物造成不利影響[29]。因此，未來研究出能夠有效滅活孢子且對(duì)食品質(zhì)量感官影響最小的處理方法至關(guān)重要[30]。

本研究觀察到了不同熱處理溫度對(duì)鴨皮中細(xì)菌群落組成及多樣性的影響，研究結(jié)果為添加鴨皮產(chǎn)品的肉制品企業(yè)在鴨皮原料安全控制、存貯條件選擇、殺菌參數(shù)確定、防腐劑復(fù)配選擇、產(chǎn)品流通條件選擇及產(chǎn)品腐敗安全風(fēng)險(xiǎn)控制等方面提供了理論依據(jù)。然而，本研究沒有評(píng)估其他環(huán)境因子對(duì)微生物多樣性的影響，這也導(dǎo)致高溫?zé)崽幚淼镍喥ぶ腥阅苡^測(cè)到較多物種，沒法得到合理解釋，此部分在后續(xù)研究中需要改進(jìn)。鴨皮作為添加原料成為脂肪等的替代品，能夠有效改善肉制品的色澤、質(zhì)地、感官等質(zhì)量指標(biāo)，且其價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于鮮肉，但由于復(fù)雜的環(huán)境因素，鴨皮中包含多種細(xì)菌，因此企業(yè)在使用鴨皮時(shí)仍需謹(jǐn)慎。企業(yè)選擇鴨皮原料的殺菌處理?xiàng)l件時(shí)應(yīng)注意：1）過高的溫度不一定能夠很有效地除菌;2）最合適的殺菌溫度分別為鴨皮中心溫度90、110 ℃處理10 min;3）對(duì)于熱處理后鴨皮的細(xì)菌控制，除了加入廣譜抑菌劑外，還要著重關(guān)注芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬，選取有效的抑菌劑格外重要。

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