基于厭氧條件下轉錄組分析的單增李斯特氏菌強啟動子的鑒定

汪舒穎， 馬俊飛， 季倩玉， 劉 箐

上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093

單增李斯特氏菌（L．monocytogenes）是一種革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，具有胞內寄生、胞間逃逸的生存特質。它與大腸桿菌、沙門氏菌等是常見于腫瘤疫苗研究的細菌活載體［1，2］。利用減毒L．monocytogenes作為細菌活載體的優勢在于不僅能通過MHCⅡ類途徑將抗原短肽遞呈給CD4＋T淋巴細胞，更重要的是由于其胞內寄生的特質，可以在宿主細胞內將抗原通過MHCⅠ類分子遞呈給CD8＋T淋巴細胞［3，4］。CD4＋和CD8＋T淋巴細胞共同參與體內的適應性免疫應答過程，其中表達CD8的細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）在腫瘤免疫治療中起到重要的作用［5，6］。在之前的研究中我們發現，重組減毒L．monocytogenes外源抗原表達水平較低，這可能是重組疫苗株未能表現出更好的免疫保護效果的原因［7，8］。因此提高在特定環境下外源蛋白在重組減毒L．monocytogenes中的表達量是推進工程單增李斯特氏菌研究發展中亟待解決的問題。

啟動子是在DNA鏈上通過與RNA聚合酶結合，從而啟動mRNA合成的一段序列，是基因表達調控中重要的組件之一［9］。在大腸桿菌和沙門氏菌活載體的研究中，為了穩定細菌在腫瘤病灶的外源蛋白表達水平，已有報道通過挖掘在厭氧培養條件下穩定的天然啟動子，或通過改造天然啟動子來優化細菌的外源蛋白表達系統［10，11］。目前有關優化啟動子的策略在微調代謝工程和合成生物學中的應用已有廣泛的研究［12，13］。其中，利用轉錄組測序技術獲得不同轉錄強度的天然啟動子已是一種較為成熟的啟動子建庫策略［14-16］。

在之前的研究中，已有通過轉錄組測序的方式，挖掘了在酸性條件下或28℃溫度中的L．monocytogenes組成型啟動子，但有關厭氧環境中L．monocytogenes強啟動子的挖掘鮮有報道［17，18］。因此，本研究通過對在厭氧和有氧條件下L．monocytogenes轉錄組數據的系統分析，確定了一組天然啟動子。利用綠色熒光蛋白報告基因對這些啟動子進行表征，篩選出活性最好的啟動子。為了探究篩選出的啟動子在不同外源蛋白轉錄過程中的適用性，我們選擇了用于腫瘤治療研究的天青蛋白和產氣莢膜梭菌θ毒素進行表達量的評估。L．monocytogenes厭氧啟動子的篩選豐富了L．monocytogenes的天然啟動子文庫，對其未來在腫瘤治療細菌活載體應用研究方面具有一定的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

菌株L．monocytogenes EGD-e由作者所在課題組前期保藏。EGD-eΔactA／inlB由課題組前期工作中構建。質粒pERL3由華中師范大學羅勤教授贈與。

1.1.2 實驗試劑

Bam HⅠ限制性內切酶，大連寶生物工程有限公司；質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，杭州博日科技股份有限公司；ClonExpress MultiS One-step Cloning kit多片段一步克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為分析純級。

1.1.3 儀器和設備

PCR儀，美國Applied Biosystems；電轉儀，電泳儀，美國Bio-Rad；凝膠成像儀，美國Gene；Nano-Drop200C，美國Thermo Fisher；振蕩培養箱，天津萊玻特瑞；厭氧培養箱，英國Baker Ruskinn；離心機，德國Eppendorf公司；酶標儀，美國Molecular Devices。

1.1.4 培養基

LB培養基和BHI培養基購買自北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 轉錄組測序樣品制備

將L．monocytogenes EGD-e以1×104CFU涂布在BHI固體平板上，分別放在厭氧培養箱和普通恒溫培養箱中，在37℃環境下培養24 h。用細胞刮刀將菌落刮下，用BHI培養基重懸，調菌液濃度到OD600＝1.0。取5 mL菌液，加入1 mL苯酚乙醇混合溶液（苯酚∶乙醇＝1∶9）后，在冰上放置30 min。將混合物在4℃下以6 000 r／min離心5 min，棄掉上清，收集菌體。將菌體重懸于50μL變容菌素和50μL溶菌酶溶液中，并轉移到1.5 mL離心管中，在37℃條件下孵育30 min。在離心管中加入1 mL Trizol破碎細菌細胞，離心后取樣品上清，并在其中加入200μL三氯甲烷進行抽提。接著用異丙醇沉淀離心后樣品水相層中的總RNA，并用75%乙醇清洗沉淀。隨后待離心管中多余的乙醇晾干后，加入30μL DEPC水，并用NanoDrop 200C檢測RNA濃度。最后將提取的RNA樣本用液氮凍存后寄送至上海生工生物工程有限公司進行轉錄組測序及分析。其中厭氧條件處理的樣本命名為EGDeAN組，有氧條件下處理的樣本命名為EGDe組。

1.2.2 厭氧啟動子的篩選及克隆

根據轉錄組測序結果，將featureCounts［19］計算得到的FPKM（每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數）作為評估樣本轉錄水平的依據，篩選厭氧培養條件下轉錄水平較高的基因。設定的篩選條件為EGDeAN組的FPKM值需顯著高于EGDe組，且EGDeAN組的FPKM值需大于1 000，EGDe組的FPKM值需小于3 000。通過與NCBI數據庫中EGDe全基因組進行比對，將篩選出的基因（見表1）上游非編碼區作為其啟動子序列。以提取的EGDe全基因組為模板，設計引物獲取啟動子片段。

表1 基于轉錄組測序結果選取的啟動子信息統計

1.2.3 重組菌株的構建方法及鑒定

綠色熒光蛋白EGFP基因序列經密碼子優化后，由上海生工生物工程有限公司合成后，設計相應的引物egfp F／R獲得egfp基因片段。用Bam HⅠ限制性內切酶對單增李斯特氏菌穿梭質粒pERL3進行單酶切后，用膠回收試劑盒獲得純化的線性化載體。使用多片段一步克隆試劑盒分別將不同的啟動子片段、egfp基因片段和線性化載體片段利用同源重組原理進行連接，獲得不同的pERL3-Promoteregfp重組質粒后，轉化大腸桿菌DH5α菌株，并在含有卡那霉素的LB瓊脂培養基上篩選陽性克隆。用引物pERL3 F／R對陽性克隆進行PCR鑒定，將目標序列長度正確的質粒送至華大基因公司測序。將測序正確的含有不同啟動子的綠色熒光蛋白基因報告質粒轉化EGD-eΔactA／inlB感受態細胞，并在含有紅霉素的BHI瓊脂培養基上篩選，用引物pERL3 F／R對陽性克隆進行PCR鑒定，序列長度正確的為表達綠色熒光蛋白的重組單增李斯特氏菌。成功構建的啟動子、egfp基因以及鑒定重組質粒的引物均展示在表2中。

表2 重組菌株所用啟動子、pERL3質粒以及egfp基因的引物列表

1.2.4 重組菌株熒光強度的測定

將表達綠色熒光蛋白的重組L．monocytogenes在含有紅霉素的BHI平板上進行活化，挑取平板上的單菌落接種到20 mL含有紅霉素的BHI培養液中，放置在厭氧培養箱中過夜培養。次日，5 000 r／min離心5 min收集菌體，并用無菌PBS溶液洗滌菌體一次，調整菌液濃度為OD600＝1.0后，取200 μL菌液至黑色96孔板，用酶標儀檢測在激發光485 nm和發射光525 nm處的熒光強度。每株菌設置3個生物學重復，結果均采用GraphPad Prism軟件進行分析，通過單因素方差分析比較組間差異。p＜0．05被認為具有統計學意義（*p＜0．05，**p＜0．01，****p＜0.000 1）。

1.2.5 外源蛋白表達菌株的構建及表達水平的鑒定

外源蛋白天青蛋白和產氣莢膜梭菌θ毒素蛋白的氨基酸序列從Uniprot網站獲得并倒推出cDNA序列，經密碼子優化，并在3’端連上了6×His標簽基因序列后，交由上海生工生物工程有限公司合成。將在厭氧培養條件下啟動綠色熒光蛋白表達水平最高的啟動子序列Pan4、天青蛋白的基因序列azu或產氣莢膜梭菌θ毒素蛋白的基因序列pfo以及Bam HⅠ單酶切后的pERL3線性化載體片段利用同源重組原理進行連接，獲得pERL3-Pan4-azu和pERL3-Pan4-pfo重組質粒。將測序正確的兩種質粒分別轉化至EGD-eΔactA／inlB中。

將重組菌株EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-azu和EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-pfo以1×104CFU涂布在含有紅霉素的BHI平板上，在厭氧培養箱中培養24 h。用細胞刮刀刮取全部菌落，接種到200 mL含有紅霉素的BHI培養基中，在37℃的厭氧培養箱中培養15 h。離心收集菌體，將菌體重懸在含有10 mmol／L Tris-HCl（pH7.5）、10 mmol／L PMSF、5 mmol／L Na2-EDTA的裂解緩沖液中。將菌體以60%功率超聲破碎，超聲2 s，間隔3 s，總時長為30 min。將超聲后的混合物在4℃條件下以12 000 r／min離心20 min，收集上清。將上清蛋白用孔徑為3 kDa的超濾管濃縮后，通過Western-blot檢測樣本中天青蛋白（～16.83 kD）和θ毒素蛋白（～55.88 kD）的表達。檢測一抗為抗His標簽的鼠單抗（Absin，上海，中國），二抗為Alexa Fluor Plus 800修飾的羊抗鼠IgG（Invitrogen，美國）。

2 結果與討論

2.1 厭氧水平下EGD-e高轉錄水平啟動子篩選

通過轉錄組測序技術對厭氧條件下（EGDeAN）和有氧條件下（EGDe）培養的EGDe基因組中2 825個基因的轉錄圖譜進行分析。如圖1所示，共表達韋恩圖顯示EGDeAN組和EGDe組共表達基因共有2 580個，EGDeAN組特有表達基因數為186個，EGDe組特有表達基因數為59個。

圖1 EGDeAN組和EGDe組基因共表達韋恩圖

對EGDeAN組和EGDe組的基因表達進行顯著性差異分析，如圖2所示，EGDeAN組的基因相對于EGDe組共有546個基因顯著上調，共有621個基因顯著下調。因為FPKM值的計算考慮了測序深度和基因長度對讀數計數的影響，是評估基因表達水平的常用方法［20］。因此從顯著上調的546個基因中，根據EGDeAN組的FPKM值大于1 000，EGDe組的FPKM值小于3 000的篩選條件，從高到低排列進行篩選，最終篩選出26個基因，如表1所示。根據NCBI數據庫中EGD-e全基因組找到每個基因的對應上游非編碼序列，以此作為該基因的啟動子區域。

圖2 EGDeAN組和EGDe組基因表達差異火山圖

2.2 熒光報告菌株的構建

為了直觀地表征篩選出的啟動子在厭氧培養條件下啟動下游基因轉錄表達的水平，如圖3所示，將篩選出的啟動子連接綠色熒光蛋白報告基因egfp構建重組熒光報告菌株EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Promoter-egfp。雖然根據轉錄組數據共篩選出了26個基因，但其中8個啟動子未能成功構建，最終成功構建了18個攜帶不同的pERL3-Promoter-egfp質粒的重組菌株，PCR鑒定結果如圖4所示。

圖3 熒光蛋白表達質粒構建圖

圖4 熒光表達菌株PCR鑒定圖

2.3 重組菌株熒光強度的測定

為了比較不同重組熒光報告菌株的熒光強度，并以此作為評估啟動子強度的標準，將菌液濃度統一調整到OD600＝1.0，并對數據進行歸一化處理，即將測得的熒光值除以OD600作為結果。如圖5所示，以EGD-eΔactA／inlB為對照組，比較了基于轉錄組測序分析結果篩選后成功構建的18個候選強啟動子和EGD-e hly基因的啟動子調控下熒光蛋白的表達水平。hly基因的啟動子是減毒L．monocytogenes活載體應用中常用的啟動子［21，22］。結果顯示，含有Pan4，Pan10，Pan12，Pan14啟動子的熒光報告菌株的熒光強度不僅均顯著高于對照組，也均高于含有Phly啟動子的重組菌株，它們的熒光值分別為Phly組的7.8倍，1.9倍，2.0倍和1.8倍。其中Pan4啟動子調控下的熒光蛋白表達水平最高，因此選擇Pan4啟動子進一步評估其應用潛力。

圖5 重組菌株EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Promoter-egfp熒光強度測定結果

2.4 Pan4啟動外源蛋白表達能力的評估

減毒L．monocytogenes可作為疫苗或藥物活載體應用于腫瘤治療中，因此在腫瘤微環境的缺氧條件下表達外源蛋白的能力十分重要。為了評估厭氧啟動子Pan4的應用潛力，利用天青蛋白和產氣莢膜梭菌θ毒素作為外源蛋白，以不表達外源蛋白的EGD-eΔactA／inlB為對照，檢測兩種蛋白在Pan4啟動子控制下的表達水平。天青蛋白和θ毒素均為兩種細菌毒素蛋白，且已在之前的研究中證明具有一定的抗腫瘤作用，是兩種可用于減毒L．monocytogenes活載體遞送的候選靶向治療蛋白［23，24］。如圖6所示，EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-pfo胞內蛋白樣本在55 kD左右有明顯的條帶，說明在Pan4啟動子調控下θ蛋白可在胞內表達。EGD-eΔactA／inlBpERL3-Pan4-azu胞內蛋白樣本在靠近17 kD左右有明顯的條帶，說明Pan4啟動子可調控天青蛋白在EGD-eΔactA／inlB中表達。由此可見，篩選出的厭氧啟動子Pan4調控外源蛋白表達的能力不僅局限于一種蛋白，具有一定的廣泛適用性。

圖6 重組菌株EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-pfo和EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-azu外源蛋白表達鑒定圖

3 結論

本文通過對在厭氧和有氧環境下培養的L．monocytogenes總RNA進行轉錄組測序分析，利用綠色熒光蛋白作為報告系統，從中篩選出在厭氧條件下表達水平有顯著性增加的啟動子Pan4、Pan10、Pan12和Pan14。其中Pan4啟動子調控下的綠色熒光蛋白表達水平最高。之后以天青蛋白和產氣莢膜梭菌θ毒素為外源蛋白，評估了該啟動子在不同外源蛋白表達調控中的作用。我們發現Pan4啟動子可以成功啟動天青蛋白和產氣莢膜梭菌θ毒素在EGD-e ΔactA／inlB中表達，這說明在厭氧環境下Pan4啟動子可調控EGD-eΔactA／inlB表達不同的外源蛋白，具有一定的廣泛適用性，可促進減毒L．monocytogenes活載體在腫瘤藥物或疫苗載體方面的應用研發。雖然Pan4啟動子是個有潛力的L．monocytogenes厭氧啟動子，但僅有一個啟動子還不足以完善減毒L．monocytogenes腫瘤藥物或疫苗活載體的外源蛋白表達系統，因此基于Pan4啟動子進行進一步人工改造是未來豐富L．monocytogenes厭氧啟動子庫的發展方向。