LncRNA RP11-789C1.1通過Wnt/β-catenin信號通路靶向miR-558調(diào)控皮膚鱗癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡

卞坤鵬 徐保來 李偉棟 田卓 (南陽市中心醫(yī)院皮膚科，河南 南陽 473000)

皮膚鱗癌是第二常見的皮膚惡性腫瘤。紫外線長期照射、放射損傷、熱損傷、致癌化學(xué)物質(zhì)是誘發(fā)皮膚鱗癌的危險因素。近年來，皮膚鱗癌的發(fā)病率呈上升趨勢，且皮膚鱗癌有高轉(zhuǎn)移風(fēng)險〔1,2〕。盡管手術(shù)、放化療等治療手段已取得進展，但局部淋巴轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移皮膚鱗癌患者10年生存率仍低于20%〔3〕。因此，探索皮膚鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，開發(fā)新的治療策略顯得至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(LncRNA)通過調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)RP11-789C1.1在胃癌組織和細胞中表達下調(diào)，過表達RP11-789C1.1抑制胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進程〔5〕。但RP11-789C1.1在皮膚鱗癌中的作用卻鮮有報道。miR-558是一種致癌基因，研究發(fā)現(xiàn)miR-558通過上調(diào)胃癌細胞乙酰肝素酶(HPSE)表達，促進胃癌細胞的增殖和遷移，促進腫瘤的形成〔6〕。生物信息學(xué)分析預(yù)測顯示，miR-558是RP11-789C1.1的潛在靶基因，但RP11-789C1.1能否靶向miR-558調(diào)控皮膚鱗癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡尚不清楚。因此，本研究通過檢測皮膚鱗癌細胞株中RP11-789C1.1和miR-558的表達情況，觀察過表達RP11-789C1.1對皮膚鱗癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，明確RP11-789C1.1和miR-558的調(diào)控關(guān)系，以期為皮膚鱗癌的分子靶向治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人永生化表皮細胞HaCaT、人皮膚鱗癌細胞A431、SCL-1和COLO16購于上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司；LipofectamineTM2000和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；pcDNA-control、pcDNA-RP11-789C1.1、miR-con、miR-558 mimics、野生型(WT)-RP11-789C1.1、突變型(MUT)-RP11-789C1.1均由上海生工公司提供；CCK-8試劑盒購于美國GlpBio公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國BD公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司；β-catenin小鼠單克隆抗體、c-Myc小鼠單克隆抗體和survivin小鼠單克隆抗體、β-actin小鼠單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠Ⅱ抗購于武漢賽維爾生物生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細胞，采用DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)A431、SCL-1和COLO16細胞，所有培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37℃，CO2體積分數(shù)5%。選取A431細胞進行后續(xù)研究。將對數(shù)期A431細胞按照每孔2×105個細胞密度接種于6孔板，當(dāng)細胞融合度約為70%時，利用LipofectamineTM2000分別將pcDNA-control、pcDNA-RP11-789C1.1轉(zhuǎn)染A431細胞，依次標記為pcDNA-control組和pcDNA-RP11-789C1.1組，轉(zhuǎn)染48 h，檢測細胞活力后進行后續(xù)實驗。為進一步證實RP11-789C1.1通過調(diào)控miR-558表達進而影響皮膚鱗癌細胞的生物學(xué)行為，將pcDNA-RP11-789C1.1分別與miR-con或者miR-558 mimics共轉(zhuǎn)染至A431細胞，依次標記為pcDNA-RP11-789C1.1+miR-con組和pcDNA-RP11-789C1.1+miR-558組，轉(zhuǎn)染48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測 分別收集對數(shù)期HaCaT、A431、SCL-1、COLO16細胞及轉(zhuǎn)染48 h的各組A431細胞，采用Trizol法分別提取細胞總RNA，微量分光光度計測定各組樣品濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為擴增模板進行熒光定量PCR反應(yīng)。分別以β-actin和U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算RP11-789C1.1和miR-558的相對表達水平。引物序列：RP11-789C1.1上游引物5′-ACAAGACCAGGAGGAGGTTT-3′，下游引物5′-GTAGTTGCTCTGGTGCTTGT-ATG-3′；β-actin上游引物5′-CCAACCGCGAGA AGATGA-3′，下游引物5′-CCAGAGGCGTA-CAGGGATAG-3′；miR-558和U6引物購于廣州銳博生物。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活力 將A431細胞按照每孔5×103細胞密度(100 μl)接種于96孔板，在細胞融合度約為70%時進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h時，每孔細胞中加入10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育2 h，軌道振動器上輕輕混合1 min，使用酶標儀測量450 nm處的吸光度值。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 侵襲實驗：向Transwell小室上室加入50 μl稀釋的基質(zhì)膠，風(fēng)干后備用。細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度。取300 μl細胞懸液(細胞數(shù)約為2×105)加入到Transwell上室，向下室內(nèi)加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，12 h時取出Transwell小室，小心擦去上室膜未發(fā)生侵襲的細胞，采用甲醇固定下室膜20 min，用0.5%結(jié)晶紫染色10 min，洗去染液后倒置于顯微鏡下觀察細胞穿膜情況，拍照并進行細胞計數(shù)，取3個視野的均值即為侵襲細胞數(shù)。遷移實驗采用未包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同侵襲實驗。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后，消化各組細胞，微量離心機2 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)基。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次。用400 μl的1×結(jié)合緩沖液懸浮細胞，使細胞濃度約為1×106個/ml，向細胞懸浮液中加入5 μl的Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8℃條件下孵育15 min，加入10 μl的PI后于2～8℃條件下孵育5 min，在1 h內(nèi)利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6Western印跡檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達水平 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞，放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液裂解細胞，獲得各組細胞總蛋白，調(diào)整細胞蛋白濃度。取適量蛋白樣品將煮沸變性后上樣至加樣孔進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后將已分離的細胞蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，采用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng)的Ⅰ抗4℃搖床孵育過夜，加入相應(yīng)的Ⅱ抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色后，凝膠成像系統(tǒng)拍照后，采用圖像處理軟件ImageJ進行灰度分析。

1.2.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?利用靶基因預(yù)測網(wǎng)站LncBase在線預(yù)測顯示，miR-558是RP11-789C1.1的潛在靶基因，隨后利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。利用LipofectamineTM2000分別將含有RP11-789C1.1-3′UTR的WT熒光素酶報告基因載體WT-RP11-789C1.1、MUT熒光素酶報告基因載體MUT-RP11-789C1.1與miR-558 mimic或miR-558-con共轉(zhuǎn)染A431細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組細胞的熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1RP11-789C1.1在皮膚鱗癌細胞株中的表達 與HaCaT中RP11-789C1.1水平(1.00±0.16)比較，A431、SCL-1和COLO 16中RP11-789C1.1的表達水平(0.23±0.04、0.27±0.03、0.25±0.04)均顯著降低(P<0.05)。

2.2RP11-789C1.1過表達對皮膚鱗癌細胞A431增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與pcDNA-control組比較，pcDNA-RP11-789C1.1組A431細胞RP11-789C1.1表達量顯著增加，表明過表達RP11-789C1.1的A431細胞株構(gòu)建成功。與pcDNA-control組比較，pcDNA-RP11-789C1.1組A431細胞活力顯著降低，凋亡率顯著增加，遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)，見表1、圖1和圖2。

表1 RP11-789C1.1過表達對A431細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及Wnt/β-catenin信號通路的影響

圖1 RP11-789C1.1過表達對A431細胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖2 RP11-789C1.1過表達對A431細胞凋亡的影響

2.3RP11-789C1.1過表達對A431細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響 與pcDNA-control組比較，pcDNA-RP11-789C1.1組A431細胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc和survivin的表達水平顯著降低(P<0.05)，見表1、圖3。

2.4RP11-789C1.1靶向調(diào)控miR-558的表達 通過LncBase網(wǎng)站進行靶基因預(yù)測顯示，miR-558和RP11-789C1.1的3′UTR存在部分連續(xù)互補配對的核苷酸序列，見圖4。miR-558和WT-RP11-789C1.1共轉(zhuǎn)染組A431細胞熒光素酶活性較miR-con和WT-RP11-789C1.1共轉(zhuǎn)染組顯著降低(P<0.05)；miR-558和MUT-RP11-789C1.1共轉(zhuǎn)染組A431細胞熒光素酶活性較miR-con和MUT-RP11-789C1.1共轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。與pcDNA-control組A431細胞miR-558表達水平(1.00±0.16)比較，pcDNA-pcDNA-RP11-789C1.1組(0.23±0.04)顯著降低(P<0.05)。

圖3 RP11-789C1.1過表達對A431細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

圖4 RP11-789C1.1與miR-558的結(jié)合位點

表2 雙熒光素酶活性實驗

2.5miR-558在皮膚鱗癌細胞株中的表達 與HaCaT中miR-558表達水平(1.00±0.13)比較，A431、SCL-1、COLO 16(4.19±0.46，3.91±0.41，4.02±0.43)顯著升高(P<0.05)。

2.6miR-558過表達逆轉(zhuǎn)RP11-789C1.1對A431細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與pcDNA-RP11-789C1.1+miR-con組比較，pcDNA-RP11-789C1.1+miR-558組A431細胞miR-558的表達量顯著增加，細胞活力顯著增加，遷移和侵襲能力顯著增加，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5、圖6、表3。

1、2：pcDNA-RP11-789C1.1+miR-con組、pcDNA-RP11-789C1.1+miR-558組；下圖同圖5 miR-558過表達逆轉(zhuǎn)RP11-789C1.1對A431細胞凋亡的影響

2.7miR-558過表達逆轉(zhuǎn)RP11-789C1.1對A431細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響 與pcDNA-RP11-789C1.1+miR-con組比較，pcDNA-RP11-789C1.1+miR-558組A431細胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc和survivin表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3、圖7。

圖6 miR-558過表達逆轉(zhuǎn)RP11-789C1.1對A431細胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表3 miR-558過表達逆轉(zhuǎn)RP11-789C1.1對A431細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及Wnt/β-catenin信號通路的影響

圖7 miR-558過表達逆轉(zhuǎn)RP11-789C1.1對A431細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

3 討 論

皮膚鱗癌是最常見的非黑色素瘤性皮膚癌之一，由于具有轉(zhuǎn)移到任何器官的能力，給生命健康構(gòu)成巨大威脅。轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)皮膚鱗癌患者往往預(yù)后不良，1年生存率約為50%〔7〕。Song等〔8〕發(fā)現(xiàn)胃癌組織中RP11-789C1.1的表達水平顯著降低，RP11-789C1.1的異常表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理轉(zhuǎn)移狀態(tài)和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期有關(guān)，低表達RP11-789C1.1患者的存活率更差。Chen等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)RP11-789C1.1在胃癌患者和細胞系中均顯著下調(diào)，沉默RP11-789C1.1通過靶向miR-5003抑制E鈣黏附蛋白(E-cadherin)表達，促進了胃癌的EMT進程。Sand等〔9〕發(fā)現(xiàn)RP11-789C1.1表達水平顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，RP11-789C1.1在皮膚鱗癌細胞中呈低表達，與Sand等〔9〕研究結(jié)論相吻合。本研究結(jié)果提示RP11-789C1.1在皮膚鱗癌中發(fā)揮抑癌基因作用，與皮膚鱗癌的進展密切相關(guān)。

LncRNA發(fā)揮miRNA分子海綿作用調(diào)節(jié)下游基因表達在癌癥的進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔10〕。已有研究表明，LINC00319通過靶向miR-1207-5p上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)3表達在皮膚鱗癌中發(fā)揮其致癌作用〔11〕。在神經(jīng)母細胞瘤組織和細胞中miR-558表達上調(diào)，下調(diào)miR-558表達可降低神經(jīng)母細胞瘤細胞的體內(nèi)外的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成能力〔12〕。在膀胱癌組織和細胞系中miR-558呈高表達，miR-558通過靶向HPSE促進膀胱癌細胞遷移、侵襲和血管生成能力〔13〕。本研究結(jié)果提示RP11-789C1.1通過靶向miR-558抑制皮膚鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，促進細胞凋亡。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在皮膚鱗癌的進展中發(fā)揮重要作用〔14，15〕。研究發(fā)現(xiàn)，敲減同源異形盒基因(HOXB)7通過抑制Wnt/β-catenin信號通路可加速皮膚鱗癌細胞凋亡，抑制皮膚鱗癌細胞遷移和侵襲〔16〕；此外，阿苯達唑通過抑制β-catenin信號傳導(dǎo)降低皮膚鱗癌細胞的干細胞特性〔17〕。本研究表明過表達RP11-789C1.1可抑制Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc和survivin的表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路活化，而過表達miR-558可逆轉(zhuǎn)RP11-789C1.1對Wnt/β-catenin信號通路的影響。提示，RP11-789C1.1通過靶向miR-558抑制Wnt/β-catenin信號通路進而抑制誘導(dǎo)皮膚鱗癌細胞凋亡，抑制其增殖、遷移和侵襲。