龍膽苦苷對過氧化氫誘導的心肌細胞損傷的保護作用及對PI3K/AKT信號通路的影響

解娜 (新鄉醫學院第三附屬醫院心內科，河南 新鄉 453003)

活性氧(ROS)積累引起的氧化應激損傷是包括缺血/再灌注損傷在內的多種心血管疾病發生發展的重要機制〔1〕。在病理情況下，ROS產生和清除失去平衡，大量的ROS能夠攻擊DNA、蛋白質和脂質膜，引發脂質過氧化，導致心肌細胞中抗氧化酶的耗竭或失活，繼而導致細胞損傷甚至細胞凋亡〔2〕。龍膽苦苷(GPS)為從龍膽科植物中提取的含環烯醚萜苷類主要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、鎮痛、保肝利膽等多種藥理活性〔3〕。此外，GPS還可提高心臟收縮能力和心肌細胞抗凋亡能力，明顯減輕缺血再灌注對心臟的損傷〔4,5〕。然而，GPS心肌保護作用機制并不明確。H9C2是從大鼠胚胎期心臟分離的細胞系，具有分裂能力，是研究心血管疾病的理想細胞模型〔6〕。本研究通過探究GPS對過氧化氫(H2O2)誘導的H9C2細胞氧化應激損傷、凋亡的影響，初步探討其潛在分子機制，以期為GPS抗心肌細胞氧化應激損傷的深入研究及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料 大鼠心肌細胞H9C2購于中國科學院典型培養物保藏中心；DMEM培養液、胎牛血清購于美國GIBCO公司；青鏈霉素雙抗溶液及丙二醛(MDA)、乳酸鹽脫氫酶(LDH)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于北京索萊寶生物公司；GPS(批號110770-201817，純度98.2%)購于中國食品藥品檢定研究院；噻唑藍(MTT)、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物公司；兔源裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3抗體、兔源B淋巴細胞瘤(Bcl)-2抗體，兔源Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體，兔源磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)抗體，兔源PI3K抗體，兔源磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗體，兔源AKT抗體購于美國CST公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養、模型構建和分組 采用DMEM培養液于37℃、CO2體積分數5%細胞培養箱中培養H9C2細胞。培養基中添加10%胎牛血清，1%的青鏈霉素雙抗溶液。采用700 μmol/L的H2O2孵育H9C2細胞24 h復制心肌細胞氧化應激損傷模型〔7〕。為檢測GPS對H9C2細胞的毒作用，用含不同濃度(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L)GPS的培養液孵育H9C2細胞24 h，MTT法檢測細胞活力，確定后續試驗GPS濃度。實驗分為正常對照(NC)組、H2O2組(700 μmol/L H2O2孵育24 h)、H2O2+GPS組(10、20、40 μmol/L的GPS預處理24 h，其余同H2O2組)。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 取1×104個H9C2細胞接種96孔板，按照實驗分組進行細胞處理，隨后棄去細胞培養液，每孔加入10 μl的MTT溶液和100 μl的DMEM培養液，培養箱繼續孵育4 h，加入100 μl的二甲基亞砜(DMSO)，酶標儀檢測570 nm波長處光密度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=〔(OD實驗孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)〕×100%

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 H9C2細胞按照上述分組干預后，胰酶消化后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用適量結合緩沖液調整為單細胞懸液。取100 μl加入流式管，分別加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl丙化碘啶(PI)，避光孵育15 min，補加結合緩沖液400 μl。混勻后，上機檢測細胞凋亡情況。

1.2.4心肌細胞損傷和氧化應激指標檢測 H9C2細胞按照上述分組干預后，吸取細胞培養液，按照ELISA試劑盒說明檢測MDA含量及LDH、AST、CK釋放量。超聲波破碎各組H9C2細胞，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明檢測CAT、SOD和GSH-Px活性及ROS水平。

1.2.5Western印跡檢測Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax和PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達水平 用預冷的細胞裂解液分別提取H9C2細胞總蛋白。蛋白定量后，取適量蛋白與等體積上樣緩沖液混合，煮沸3 min使其變性。取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。利用濕法轉膜裝置將分離的細胞蛋白轉移至硝酸纖維素(NC)膜。將NC膜置于5%脫脂牛奶中37℃封閉1 h。洗膜后，將其置于1∶1 000稀釋的一抗溶液中37℃孵育2 h。洗膜后，將其置于二抗溶液中37℃孵育1 h。將膜置于化學發光顯色液中避光顯影。以β-actin為內參，圖像處理軟件分析目的蛋白相對表達水平。

1.3統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度龍膽苦苷對心肌細胞存活的影響 用不同濃度的龍膽苦苷干預H9C2細胞24 h，MTT法檢測細胞存活率顯示，NC組、GPS 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L組細胞存活率分別為(101.82±2.68)%、(103.78±1.86)%、(108.46±6.30)%、(105.59±6.81)%、(107.51±0.99)%、(99.10±2.04)%、(93.71±5.45)%、(79.24±2.22)%。當GPS濃度達到20.0 μmol/L時H9C2細胞存活率顯著升高，當GPS濃度達到80.0 μmol/L時對H9C2細胞表現出顯著的細胞毒作用。選擇10.0、20.0、40.0 μmol/L的GPS濃度進行后續實驗。

2.2不同濃度龍膽苦苷對H2O2誘導的心肌細胞損傷的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞上清液中LDH、AST、CK釋放量、MDA含量顯著升高；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞上清液中LDH、AST、CK釋放量、MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度龍膽苦苷促進H2O2處理對心肌細胞損傷、凋亡及Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

2.3不同濃度龍膽苦苷對H2O2誘導的心肌細胞凋亡的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞凋亡率顯著升高；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1和圖1。

2.4不同濃度龍膽苦苷對H2O2誘導的心肌細胞凋亡蛋白表達的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達顯著升高、Bcl-2蛋白表達顯著降低；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達顯著降低、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖2。

2.5不同濃度的龍膽苦苷對H2O2誘導的心肌細胞活性氧產生的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞ROS含量顯著升高；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞ROS含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

圖1 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡

2.6不同濃度的龍膽苦苷對過氧化氫誘導的心肌細胞CAT、SOD和GSH-Px活性的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞CAT、SOD和GSH-Px活性顯著降低；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞CAT、SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.7不同濃度龍膽苦苷對過氧化氫誘導的心肌細胞AKT信號通路的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞p-PI3K和p-AKT表達水平顯著降低；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞p-PI3K和p-AKT表達水平顯著升高(P<0.05)。見表2和圖3。

表2 不同濃度龍膽苦苷H2O2處理心肌細胞ROS、CAT、SOD、GSH-Px、p-PI3K、PI3K、AKT和p-AKT表達的影響

圖3 檢測心肌細胞中p-PI3K、PI3K AKT和p-AKT蛋白表達

3 討 論

GPS作為一種傳統中藥，在我國已廣泛用于治療類風濕關節炎、胃痛等疼痛和炎癥性疾病。研究顯示，GPS可能通過抗炎、抗氧化機制對大鼠骨關節炎、乙醇誘導的小鼠胃黏膜損傷具有保護作用〔8,9〕。GPS通過抑制核因子-κB和絲裂原激活的蛋白激酶信號通路減輕星形膠質細胞介導的炎性反應進而預防神經元損傷〔10〕。此外，GPS還可減輕內皮細胞氧化應激損傷和凋亡，發揮內皮細胞保護作用〔11〕。

H2O2是超氧陰離子、羥基自由基等高活性氧自由基的主要前體，可誘導細胞氧化應激損傷和凋亡。MDA是細胞脂質過氧化反應終產物，其含量高低可反映細胞氧化損傷程度〔12〕。正常心肌細胞內存在LDH、AST、CK等多種心肌酶類，其釋放量增加提示細胞通透性改變或細胞損傷〔13〕。CAT、SOD和GSH-Px是機體內重要的抗氧化化酶，可抑制自由基產生，平衡機體代謝，然而ROS的大量產生導致CAT、SOD和GSH-Px耗竭，破壞機體氧化和抗氧化動態平衡，誘導氧化應激損傷〔12〕。本研究顯示，GPS預處理可顯著提高H2O2誘導的H9C2細胞中CAT、SOD和GSH-Px活性，降低細胞ROS水平，抑制MDA產生以及LDH、AST、CK的釋放，提示GPS可能通過增強H9C2細胞抗氧化能力減輕H2O2誘導H9C2細胞損傷。

過量的氧化應激可誘導心肌細胞凋亡〔14〕。Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax細胞是參與細胞凋亡調控的重要蛋白。Bcl-2和Bax屬于Bcl家族，Bax表達增加可促進線粒體細胞膜電位改變，促進細胞色素C釋放，激活caspase途徑促進細胞凋亡發生，而Bcl-2則通過與Bax結合形成異源二聚體發揮抗凋亡作用〔15〕。本研究顯示，GPS預處理可減輕H2O2誘導H9C2細胞凋亡，提高Bcl-2表達，降低Cleaved caspase-3和Bax表達水平，提示GPS可能通過線粒體途徑抑制H2O2誘導的H9C2細胞凋亡。

PI3K/AKT信號通路是調節細胞生存、生長和凋亡的重要細胞內信號通路〔16〕。研究顯示，PI3K/AKT通路的激活可促進心肌細胞的存活，保護心臟免受缺血/再灌注損傷，抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡〔17,18〕。此外，GPS可能激活PI3K/AKT信號通路對人臍靜脈內皮細胞氧化應激損傷具有保護作用〔11〕。為探討GPS對H2O2誘導的H9C2細胞損傷保護作用機制，本研究檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達水平，結果顯示GPS預處理可降低H2O2誘導對PI3K、AKT磷酸化的抑制作用，提示GPS對H2O2誘導的H9C2細胞保護作用可能與激活PI3K/AKT信號通路有關。綜上所述，GPS可減輕H2O2誘導的心肌細胞氧化應激損傷和凋亡，其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關，這為GPS用于預防心肌細胞氧化應激損傷奠定了理論基礎。