LncRNA NEAT1在結核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞中表達及作用機制

王玲 李君 丁國祥 (青海省第四人民醫(yī)院 呼吸五科，青海 西寧 80000；檢驗科)

肺結核俗稱肺癆，是結核病中最常見的一種慢性消耗性傳染疾病〔1〕。資料顯示，全球每年肺結核新發(fā)患者約800萬人，年死亡人數(shù)約140萬人，且其發(fā)病率與死亡率呈逐年上升趨勢，已成為嚴重威脅人類健康的重要疾病之一〔2〕。臨床顯示，肺結核主要是由結核分枝桿菌引起的，但結核分枝桿菌的致病機制至今仍未完全清楚〔3〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在真核生物體內表達廣泛，能夠參與機體遺傳調節(jié)、轉錄、翻譯等生物學過程〔4〕。LncRNA核富集轉錄體(NEAT)1是一種在細胞核內表達的LncRNA〔5〕。近期研究表明，肺結核患者外周血單個核細胞中LncRNA NEAT1表達上調，且其表達情況與肺結核疾病的進展及轉歸有關〔6〕。但LncRNA NEAT1在結核分枝桿菌致病過程中的生物學調節(jié)機制目前尚鮮有報道，本研究為進一步分析LncRNA NEAT1與結核分枝桿菌感染的過程，通過分析LncRNA NEAT1在結核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞中的表達情況，旨在探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1細胞與主要試劑 肺泡Ⅱ型細胞RLE-6TN(編號為BNCC337708)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；卡介苗(BCG)疫苗凍干粉購自北京生物制品研究所；RPMI1640完全培養(yǎng)液、羅氏培養(yǎng)基購自武漢純度生物科技有限公司；抗Toll樣受體(TLR)4、髓樣分化因子(MyD)88、腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6、磷酸化(p)-核轉錄因子(NF)-κB抗體及抗β-actin抗體購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；RNA提試劑盒、蛋白提取試劑盒、反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和分組 將RLE-6TN細胞復蘇后，轉入RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞融合度達到90%時，棄去培養(yǎng)液，用1 ml(37℃)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1次，胰酶消化后，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，取對數(shù)期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2細菌的制備 BCG疫苗每支用稀釋液進行稀釋，接種于羅氏斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 w后，取生長良好的BCG于勻漿器中，加少量生理鹽水(0.05% Tween-80)研磨，以RPMI1640完全培養(yǎng)液稀釋成菌懸液，調整細菌濃度(5 mg/ml)。

1.2.3細菌感染 細胞取對數(shù)生長期細胞用，培養(yǎng)至6 孔板，胰蛋白酶消化后，RPMI1640完全培養(yǎng)液制備細胞懸液，待細胞融合度至50%時，棄去培養(yǎng)液，根據(jù)感染復數(shù)(MOI)，細菌數(shù)與細胞數(shù)之比的不同，加入終濃度為0.0、0.1、1.0、10.0 MOI重懸菌的RPMI1640完全培養(yǎng)液，每組細胞設置3組重復，將細胞置于(37℃、5%CO2)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用直接涂片抗酸染色鏡檢，結核桿菌呈亮紅色，結核桿菌數(shù)目≥3條/視野為細胞培養(yǎng)成功。分別在6、12、24 h時取對照組與重懸菌處理組的RNA、蛋白質和培養(yǎng)液上清，以備后續(xù)檢測。

1.2.4qPCR檢測 NEAT1、miR-146a、TLRs信號通路相關分子及炎癥因子白細胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA的水平取上述各樣本提取RNA，檢測RNA濃度及純度，采用反轉錄試劑盒反轉錄得cDNA，采用qPCR試劑盒進行NEAT1、miR-146a及TLRs信號通路相關分子mRNA相對定量分析，反應體系20 μl，反應條件為95℃ 10 s、60℃ 20 s、70℃ 10 s，共40個循環(huán)，所有樣品重復測定3次。以β-actin作為內參(miR-146a內參為U6)，采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達水平，內參及目的基因的引物序列見表1。

1.2.5Western印跡檢測TLRs信號通路及炎癥相關蛋白的水平 采用蛋白提取試劑盒提取上述樣本總蛋白，Lowry法進行蛋白定量，繪制標準曲線，并計算樣品實際濃度，用PBS將蛋白稀釋至同一濃度，取30 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，常規(guī)轉膜，封閉后，加入Ⅰ抗溶液，4℃孵育過夜，第2天室溫平衡30 min，用TTBS(0.1% Tween-20)洗膜3次，每次10 min，加入相應Ⅱ抗，在雜交盒中，室溫搖床孵育1.5 h，PBS洗膜2次，電化學發(fā)光(ECL)顯色，Quantity One凝膠成像分析軟件拍照并分析各蛋白相對表達量。每組均設3組重復，以β-actin作為內參照。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1LncRNA NEAT1在結核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型RLE-6TN細胞中的表達情況 在相同MOI條件下，24 h時RLE-6TN細胞中NEAT1的表達水平顯著高于0、6、12 h時(P<0.05)，12 h時RLE-6TN細胞中NEAT1的表達水平顯著高于0、6 h時(P<0.05)，6 h時RLE-6TN細胞中NEAT1的表達水平顯著高于0 h時(P<0.05)。在相同時間條件下，10.0 MOI組肺泡Ⅱ型細胞中NEAT1的表達水平顯著高于0.0 MOI組、0.1 MOI組、1.0 MOI組(P<0.05)，1.0 MOI組的RLE-6TN細胞中NEAT1的表達水平顯著高于0.0 MOI組和0.1 MOI組(P<0.05)；0.1 MOI組的RLE-6TN細胞中NEAT1的表達水平顯著高于0.0 MOI組(P<0.05)，見表2。

2.2生物信息學軟件預測miR-146a是NEAT1下游的靶基因 SatrBase搜索生物信息學預測結果顯示，miR-146a是NEAT1下游的直接靶標，見圖1。

表2 LncRNA NEAT1在結核分枝桿菌感染不同時間點RLE-6TN細胞中的表達情況

圖1 生物信息學軟件預測miR-146a是NEAT1下游的靶基因

2.3RT-qPCR檢測miR-146a及TLRs信號通路相關分子mRNA的表達情況 以MOI=10.0的結核分枝桿菌感染RLE-6TN細胞，結果顯示，與0 h時相比，6、12、24 h 時RLE-6TN細胞中的miR-146a表達水平顯著降低(P<0.05)，MyD88 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，呈時間依賴性；TLR4 mRNA表達水平在6 h、12 h時顯著升高(P<0.05)，24 h時顯著降低(P<0.05)，NF-κB mRNA水平變化的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 感染不同時間點miR-146a及TLRs信號通路相關分子的mRNA表達情況

2.4TLRs信號通路相關分子的蛋白水平變化 與0 h時相比，6 h時RLE-6TN細胞中TLR4的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，12 h時顯著降低(P<0.05)，24 h時顯著升高(P<0.05)；6、12、24 h MyD88、TRAF6、p-NF-κB/NF-κB蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，呈時間依賴性，見圖2，表4。

圖2 RLE-6TN細胞感染結核桿菌不同時間TLRs信號通路相關分子蛋白水平的變化情況

2.5RLE-6TN細胞炎癥因子mRNA表達情況 與0 h時相比，6、12、24 h時RLE-6TN細胞中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05)，呈時間依賴性，見表5。

表4 感染不同時間點TLRs信號通路相關蛋白表達情況

表5 感染不同時間點RLE-6TN細胞中炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α mRNA水平的比較

3 討 論

肺結核是全球范圍內最重要的傳染疾病，肺結核的發(fā)病機制十分復雜，其中結核分枝桿菌是引起肺結核患者發(fā)病的首要因素〔7〕。結核分枝桿菌是一類典型的胞內寄生菌，其感染過程中涉及固有性免疫與適應性免疫，與抗原遞呈、細胞因子釋放等過程的機體免疫應答及炎癥反應密切相關〔8〕。肺泡Ⅱ型細胞又稱為顆粒肺泡細胞，約占肺泡總數(shù)的75%左右，具有增殖、分泌肺表面活性物質、維持肺泡內外液體平衡及免疫調節(jié)等過程〔9〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肺泡Ⅱ型細胞在多種生理及病理條件下，能夠分泌多種細胞因子、炎癥因子，參與炎癥反應過程，與肺結核的發(fā)病過程密切相關〔10〕。

LncRNA結構與mRNA相似，在真核生物體內表達廣泛，能夠參與許多生物學過程及細胞活動〔11〕。譚楊等〔12〕研究表明，巨噬細胞在結核分枝桿菌感染后，篩選出多種差異表達的LncRNAs，但未對這些LncRNA在結核病中的具體生物學機制進一步研究。NEAT1是LncRNA中的一種，能夠參與機體內的免疫調節(jié)〔13〕。Morchikh等〔14〕研究表明，NEAT1與HEXIM1能形成多亞基復合物，參與調節(jié)DNA介導的先天免疫反應。本研究結果提示NEAT1表達上調可能參與結核分枝桿菌對肺泡Ⅱ型細胞感染過程。但具體生物學機制尚不清楚。

本研究結果表明miR-146a是NEAT1下游的直接靶標。miR-146a是最早證實與炎癥相關的miRNAs之一〔15〕。以上結果提示結核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞的生物學調節(jié)機制可能與NEAT1對miR-146a的調控有關。孫波等〔16〕研究表明，胃黏膜組織中miR-146a可能通過TLR4/NF-κB信號通路介導炎性反應。TLRs是天然防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，其介導的炎癥信號通路在心肌損傷及心肌炎等一系列炎癥反應中具有關鍵作用〔17〕。馬渝等〔18〕研究表明，miR-146a在膿毒癥患者肺組織內表達上調，可抑制TNFα釋放，減輕炎癥反應。楊汀等〔19〕研究表明，miR-146a的作用靶點為TRAF6和IRAK-1的3′-UTR區(qū)，其能夠下調IRAK1和TRAF6水平。本研究結果提示TLR4可能在早期僅具有細胞識別作用，但整體上結核分枝桿菌感染RLE-6TN細胞能夠促進TLR4的表達。結核分枝桿菌感染細胞后，RLE-6TN細胞中NF-κBmRNA及蛋白表達變化無統(tǒng)計學意義，而其活化形式p-NF-κB蛋白水平顯著升高，呈時間依賴性，與TRAF6、MyD88 mRNA及其蛋白變化趨勢一致，提示結核菌感染細胞后可能會激活TLRs-NF-κB信號通路。本研究與郭茂等〔20〕研究結果一致。郭茂等〔20〕研究表明，右美托咪定處理膿毒癥小鼠外周血單核細胞后，細胞中miR-146a呈高表達，可明顯抑制小鼠炎癥因子TNF-α、IL-6水平，其機制可能與抑制TLR4-NF-κB信號通路中重要接頭蛋白TRAF6、IRAK-1表達有關。提示結核分枝桿菌感染RLE-6TN細胞過程中可能通過激活TLR4-NF-κB信號通，促進促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α表達，導致感染發(fā)生。

綜上，LncRNA NEAT1在結核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞中表達上調，NEAT1可能通過靶向miR-146a，參與調控TLRs信號通路活化及誘導炎癥因子的表達。然而LncRNA NEAT1在結核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞中的具體生物學調節(jié)機制還不清楚，仍需進一步進行研究。