長鏈非編碼RNA NEAT1在急性缺血性腦卒中的診斷價值

鄭海建 王翎 劉廣嵐 潘旭東

(1連云港市贛榆區人民醫院 揚州大學醫學院附屬醫院神經內科，江蘇 連云港 222100；2蘇州大學附屬第一醫院全科醫學科)

急性缺血性腦卒中(AIS)占全部腦卒中的60%～85%，是腦卒中最常見的一種類型，AIS的發病機制是一個多環節、多因素、多機制的惡性級聯過程，其中腦缺血再灌注損傷(I/R)及其炎癥反應是引起神經損傷的重要因素。目前AIS的診斷主要依靠神經影像技術，但由于昂貴的成本和侵襲性并不適合所有患者〔1〕，因此，探索無創高敏感性生物標志物用于AIS的早期診斷至關重要。長鏈非編碼RNA核富集豐富的轉錄本(LncRNA NEAT)1與許多細胞內調節因子相互作用，在心、腦血管病病理過程中發揮關鍵作用，在I/R過程中表達上調，LncRNA NEAT1能通過誘導凋亡途徑直接相關的下游因子而造成細胞損傷，參與腦卒中的病理過程〔2〕。本研究分析LncRNA NEAT1在AIS中的診斷價值，可以為該病的診斷及預后評估提供理論參考。

1 對象與方法

1.1研究對象 病例組：選自2019年8月至2020年4月就診于連云港市贛榆區人民醫院神經內科住院的AIS患者83例(AIS組)，其中男46例、女37例，年齡在40～90歲；入組標準：①發病72 h內；②患者診斷均符合中國急性缺血性腦卒中診治指南(2014)診斷標準〔3〕，而且經頭顱CT或磁共振成像(MRI)檢查發現相對應的責任病灶；③MRI證實AIS。排除標準:①既往腦卒中病史；②存在急性炎癥、腫瘤、嚴重心臟、肝、腎及血液系統疾??；③手術及外傷史；④彌漫性肌肉疾病史；⑤自身免疫性疾病。對照組(NC組)：選取同期就診于醫院門診體檢者40例，其中男19例、女21例，年齡40～90歲。納入及排除標準：體格檢查中無腦血管病證據和(或)頭顱MRI/CT檢測正常者，排除患嚴重肝、腎疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病。

1.2標本采集與檢測 受試者均隔夜禁食12 h，于清晨安靜狀態下留取空腹靜脈血5 ml，標本用無菌試管留取，枸櫞酸鈉抗凝。室溫放置2 h后，以5 000 r/min離心10 min后，分離血漿，取血漿凍存于-80℃冰箱待檢。5 ml注入生化專用的試管，分離血清，西門子ADvia2400全自動生化分析儀檢測生化指標，包括空腹血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。檢測條件符合實驗室質控標準，檢測結果可靠。

1.3血漿LncRNA NEAT1及IL-8測定 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血漿LncRNA NEAT1表達，試劑盒由美國Applied Biosystems公司提供，檢測儀型號ABI-7300；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿白細胞介素(IL)-8；試劑盒由上海富勒生物科技有限公司提供，所有操作按照試劑盒說明書步驟進行。

1.4觀察項目、指標、評價標準 神經功能缺損評分用美國國立衛生研究院腦卒中量表(NIHSS)評定〔4〕。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、秩和檢驗、Pearson相關分析，非正態分布資料采用Spearman非參數統計分析。用受試者工作特征(ROC)曲線評估血漿LncRNA NEAT1對AIS的診斷效能。

2 結 果

2.1兩組一般特征及AIS危險因素比較 兩組比較性別、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史、TC、LDL-C、GLU差異無統計學意義(P>O.05)。兩組年齡、TG、HDL-C、IL-8比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2兩組血漿LncRNA NEAT1比較 AIS組血漿LncRNA NEAT1表達量高于NC組，差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 兩組的基本信息比較

2.3AIS組血漿LncRNA NEAT1與NIHSS及一般資料的相關性 血漿LncRNA NEAT1與NIHSS (r=0.460，P=0.000)、IL-8(r=0.324，P=0.003)呈正相關，與年齡(r=0.168，P=0.130)、TC(r=0.038，P=0.734)、TG(r=-0.120，P=0.280)、LDL(r=0.109，P=0.325)、HDL-C(r=-0.065，P=0.559)、GLU(r=-0.011，P=0.918)均無顯著相關性。

2.4ROC曲線分析 LncRNA NEAT1對AIS患者的診斷價值較大，最佳診斷界值為0.019，約登指數為0.486，ROC曲線下面積(AUC)為0.747，95%CI為0.657～0.837。

3 討 論

AIS主要是由于頸動脈或椎動脈血栓栓塞而導致血流突然中斷或減少，血氧及營養物質不能滿足神經細胞正常功能需求，導致神經細胞的缺血、壞死，進而引起神經功能障礙的臨床癥狀綜合征。AIS的病理生理過程復雜，I/R在缺血性腦血管病急性期的各個環節中起著重要作用。再灌注對于缺血性腦組織恢復正常功能是必不可少的，但它可能導致繼發性損傷；由于腦缺血恢復血液再灌注后，包括再灌注時氧自由基爆發、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應、細胞凋亡等一系列級聯反應使得神經損傷和功能障礙反而進一步加重；首先，腦缺血后早期再灌注損傷可加重缺血程度而導致二次缺血損傷的病理生化級聯反應〔5〕。其次，在腦缺血發作后幾分鐘到幾小時內，常駐細胞的激活會引發一系列炎癥事件。而炎癥帶來的腦繼發性損傷的治療時間窗較動脈閉塞后的原發性損傷更長〔6〕。第三，腦I/R損傷的發病機制中氧化應激起重要作用。由于氧自由基過量產生引起的氧化應激可誘導核因子(NF)-κB信號通路激活，導致促炎癥因子釋放〔IL-8，IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α〕，從而導致血腦屏障破壞和血管性水腫而加重腦卒中的臨床癥狀〔7〕。

LncRNA NEAT1是心腦血管疾病病理過程中的關鍵因素。I/R損傷小鼠模型中觀察到LncRNA NEAT1對心肌炎性反應有促進作用，并用抑制LncRNA NEAT1可敲低動脈粥樣硬化相關事件〔8〕。針對I/R損傷小鼠模型中研究表明，LncRNA NEAT1促進氧葡萄糖剝奪/復氧(OGD/R)損傷和小膠質細胞的神經炎癥損害，并能增強血管內膜的厚度或血管閉塞后通過調節血管平滑的表型轉化使細胞過度凋亡，參與AIS的病理過程，表明LncRNA NEAT1可能是AIS診斷和治療靶標〔2〕。本研究結果表明AIS患者體內血漿中LncRNA NEAT1表達明顯增加，此指標的高表達參與了AIS的發生和發展。且LncRNA NEAT1對AIS的診斷有一定的準確性，其診斷效能中等。

LncRNA NEAT1高表達可增加AIS嚴重程度，LncRNA NEAT1高表達可能會增強腦微循環功能障礙，通過調節β-catenin信號通路，導致正常腦血管發生生理、病理性改變，從而增加疾病的嚴重程度；并且lncRNA NEAT1還可通過促進內膜增厚或血管閉塞調節血管平滑肌細胞的表型轉化及上皮細胞過度凋亡，從而增強動脈粥樣硬化病變并加重AIS的嚴重程度〔9〕；本研究結果發現：AIS患者血漿LncRNA NEAT1的表達與NIHSS評分呈顯著正相關，表明LncRNA NEAT1的表達量可以用于AIS病情嚴重程度的預測或判斷，其表達量越高，疾病的嚴重程度越重。

NEATl可作為脯氨酸/谷氨酰胺富集剪切因子負性調節因子使炎癥因子如IL-8表達增加，從而在炎癥反應中起重要的作用，在AIS的炎癥反應中，報道最多的細胞因子是TNF-α、IL-10、IL-8、IL-20和轉化生長因子(TGF)-β，其中IL-8和TNF-α可加劇腦損傷，而TGF-β和IL-10 卻可能有神經保護作用，促炎癥因子的增加與低水平抗炎癥因子都會引起更大的壞死區和嚴重的臨床后果〔10〕。本研究提示LncRNA NEAT1與AIS的炎癥水平和病情進展有關。LncRNA NEAT1高表達可能會加速疾病的發展，它可通過調節并促進炎癥反應而定位一些靶基因或途徑在腦卒中的發生、發展中起作用。國內有研究報道〔11〕老年動脈硬化性腦卒中患者早期主要是發生促炎反應，隨著梗死時間的延長，人體通過誘導大量外周血調節性T細胞而抑制促炎因子的表達，抑制過度的炎癥反應，調節免疫平衡。

綜上所述，血漿LncRNA NEAT1對AIS有一定的早期診斷價值，診斷效能較好，可作為一種新型生物標志物，有助于判斷疾病的炎癥水平及嚴重程度。