親子鑒定中Penta E稀有等位基因28的確認1例

徐冬冬，王韻，楊慧凌，范慶煒，杜冰

(川北醫學院基礎醫學與法醫學院，四川 南充 637000)

1 案例資料

1.1 簡要案情

1例需鑒定父子關系的個人委托案例，委托人陳某(男性，36歲)為了申報戶口要求確定與孩子陳某某(女性，6歲)父子親緣關系。

1.2 檢驗過程與結果

1.2.1 初次檢驗 采用Chelex-100法提取血樣DNA，分別使用PowerPlex?Fusion(美國Promega公司)和AGCU EX21+1(江蘇無錫中德美聯生物技術有限公司)試劑盒進行復合擴增，采用ABI 3500遺傳分析儀進行毛細管電泳和基因分析。兩個STR試劑盒所檢驗的39個STR位點中除Penta E基因座外，其余基因組符合孟德爾遺傳規律。在Penta E基因座，Bin內被控父與孩子均只有一個等位基因，分別為“11”和“18”；Bin外約477bp處各有一個檢出峰，將其手動命名為off-ladder峰(以下簡稱OL峰)。相同實驗條件下，進行1次重復檢驗，分型結果不變。按照人類DNA熒光標記STR分型結果的分析及應用(GA/T 1163-2014)和法醫學STR基因座命名規范(SF/Z JD0105011-2018)中OL等位基因的分析方法，將該OL等位基因命名為等位基因“28”。見圖1。

1.2.2 交互驗證 分別采用AGCU EX22(江蘇無錫中德美聯生物技術有限公司)和Microreader 21 ID System(北京閱微基因技術有限公司)試劑盒檢測兩人血樣。分析顯示，與上述2個檢測試劑盒共同的STR基因座(PentaE 除外)分型一致。在Penta E基因座，被控父基因型為“11，28”，孩子的基因型為“18，28”。見圖2。

1.2.3 測序驗證 參照STRBase(https://strbase.nist.gov)中Penta E引物序列(正向引物為：5′-ATTACCAACATGAAAGGGTACCAATA-3′，反向引物為：5′-TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACAATTT-3′)合成引物進行單基因擴增檢測，將目的條帶純化后進行一代測序。Penta E基因座的核心基序為[AAAGA]，OL的核心序列是[AAAGA]28，根據國際法醫遺傳學會推薦的STR命名方法，將該等位基因命名為“28”。

1.2.4 父權指數計算及鑒定意見 按照《親權鑒定技術規范》(GB/T37223-2018)，采用中國漢族群體遺傳學資料[1]，計算4個STR試劑盒所包含的39個常染色體基因座的累積親權指數(combined paternity index，CPI)為4.8317×1015，支持認定父子關系。

2 討論

在親子鑒定中，當出現被控父(和或母)與孩子在某個STR基因座的分型結果不符合遺傳規律時，除考慮該基因座發生突變外，還應注意是否存在等位基因漏檢的可能[2]。研究表明，90%以上的STR突變為一步突變，多步突變發生的機會較小[3]。因此，本案Penta E基因座被檢父等位基因“11”發生7步突變為“18”的可能性很低。進一步分析分型圖譜發現，被檢父和孩子在Bin外相同位置存在檢出峰，推測該基因座存在等位基因漏檢的可能。采用AGCU EX22和Microreader 21 ID System試劑盒進行核驗，證實PowerPlex?Fusion試劑盒在Penta E基因座的分型漏檢了被檢父和孩子的等位基因“28”。 Penta E等位基因“28”是罕見的等位基因，澳大利亞Grover首次在STRbase中對該稀有等位基因進行了報道[4]，國內已報道的其在漢族群體基因頻率為0.000 2[1]。

研究表明，OL等位基因的形成原因有4種[5]：(1)重復單位完整重復，但重復次數在等位基因分型參照物范圍外，如本例中的Penta E等位基因“28”，比分型標準物最大等位基因“24”多4個重復單位；(2)重復單位不完整重復，如TH01基因座等位基因“9.3”；(3)側翼序列堿基的插入或缺失，如D7S820等位基因9.1，是由側翼序列插入1個C堿基導致；(4)較大片段的缺失，如D21S11等位基因21.1，是核心序列區29 bp的缺失導致。對于檢案工作中遇到的可疑OL等位基因，首先應通過重復擴增或更換其它STR試劑盒進行核驗，以排除污染或非特異性擴增等影響[6]。其次，根據檢出峰特征綜合分析，對于出現在基因座兩個相鄰等位基因之間的OL等位基因，一般屬于等位基因的微變異，不易出現分型誤判；對于超出基因座Allelic Ladder之外的OL等位基因，其分型確定較為復雜。此類OL等位基因屬于大片段或小片段等位基因，可能落入相鄰基因座，易引起誤判[7]。由于PCR-CE檢測到的OL等位基因只反映出其長度大小，不能確定具體形成原因。因此，建議對檢案中遇到的OL等位基因進行序列測定，以便使分型結果更加嚴謹、準確。OL等位基因在人群中的基因頻率一般較低，有些屬于稀有等位基因(頻率<0.1%)[8]。低頻率的OL等位基因的發現和確證，可顯著提高個體識別能力和排除概率，有助于檢案和研究[9-10]。