NapsinA、CGA及CK7在肺癌患者中的表達及與臨床病理的關系分析

黃玉惠，余婧，李景

(成都市雙流區第一人民醫院病理科，四川 成都 610200)

肺癌是起源于肺支氣管上皮黏膜組織或腺體組織的原發性癌，依據病理組織學不同分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占所有肺癌的85%～90%[1]。肺癌的發病呈家族聚集性，遺傳、職業暴露、環境、不良飲食、吸煙、基因突變等因素均是肺癌發病的高危因素[2]。早期肺癌的檢出率約為15%，局部晚期或轉移期肺癌的診斷率可達75%[3]。早期肺癌多通過手術切除、化學治療、靶向分子治療等方式進行，晚期肺癌伴轉移患者則多采用免疫療法進行治療。盡管靶向分子技術和精準醫療在肺癌的臨床診斷和治療中應用日漸廣泛，一定程度可提高肺癌患者的生存率，但晚期肺癌生存率仍不足15%[4]。天門冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、嗜鉻粒蛋白A(chromograninA，CGA)和細胞角蛋白7(Cytokeratin 7，CK7)作為腫瘤特異性標志物，被證實可輔助鑒別肺癌組織學類型，幫助明確病情，制定合適的治療方案及預測預后[5]。本研究旨在探討天門冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、嗜鉻粒蛋白A(CGA)及細胞角蛋白7(CK7)在肺癌患者中的表達及與臨床病理的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2019年11月成都市雙流區第一人民醫院收治的109例肺癌患者的肺癌組織及癌旁組織為研究對象。109例患者中，男性64例，女性45例；年齡為29～74歲，平均(50.34±6.87)歲；有吸煙史77例，無吸煙史32例；病理類型：肺腺癌31例，肺鱗癌24例，大細胞癌8例，小細胞癌46例；低分化癌23例，中分化癌55例，高分化癌31例；TNM分期：I～II期42例，III～IV期67例；出現淋巴結轉移38例，未出現淋巴結轉移71例；手術治療15例，放療41例，化療53例。納入標準：(1)符合《中國原發性肺癌診療規范(2015年版)》[6]中指出的肺癌相關診斷標準，術中取病理標本，均經病理證實為肺癌者；(2)入院前未接受過放、化療、免疫治療等抗腫瘤治療者；(3)年齡≥18周歲。排除標準：(1)合并糖尿病、冠心病等基礎疾病者；(2)重要器官功能不全者；(3)合并其他慢性肺功能疾病者；(4)合并其他惡性腫瘤疾病者。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有患者性別、年齡、吸煙史等一般資料，同時收集其病理類型、腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況等臨床資料。對所有患者進行為期兩年的隨訪，隨訪方式包括定期入院復查隨訪及電話隨訪。

1.2.2 NapsinA、CGA、CK7在肺癌組織及癌旁正常組織表達情況 取肺癌患者癌組織及臨近癌旁組織標本(距腫瘤邊緣5 cm處)[7]，以10%中性甲醛固定后脫水制成石蠟切片，采用免疫組織化學技術S-P法[8]檢測癌組織及癌旁正常組織中NapsinA、CGA、CK7的陽性表達。將癌組織和癌旁組織標本石蠟切片貼附于預涂有多聚賴氨酸的載玻片上，加熱至60 ℃烘烤2 h，梯度二甲苯脫蠟至水后浸泡，取出切片置于pH值為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中，加熱至100 ℃維持10 min后冷卻，pH值為7.4的枸櫞酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加兔抗NapsinA(貨號：ab129189，abcam公司)、CGA(貨號：ab92738，abcam公司)、CK7單克隆抗體(貨號：ab68459，abcam公司)，37 ℃條件下孵育1 h，pH值為7.4的枸櫞酸鹽緩沖液再次沖洗3次后滴加生物素標記的相應山羊抗兔二抗，37 ℃條件下孵育40 min，pH值為7.4的枸櫞酸鹽緩沖液再次沖洗3次后滴加DAB顯色液，水洗后蘇木素復染30 s，蒸餾水沖洗5 min后梯度乙醇脫水后透明封片。

1.2.3 免疫組化結果進行判定 以枸櫞酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，已知肺癌陽性切片作為陽性對照對結果進行判定。NapsinA、CGA和CK7均定位于細胞質中，當細胞質被染色成黃色或棕黃色，且呈明顯顆粒狀視為陽性[9]。隨機選擇陽性細胞區域的10個高倍視野，結合陽性細胞占比和染色強度對染色結果進行評分，陽性細胞占比為0%記0分，1～10%記1分，11～50%記2分，50%以上記3分；染色強度無上色記0分，上色較弱記1分，上色程度中等記2分，上色程度較強記3分?？偡?陽性細胞占比得分×染色強度得分，將總分為0分判定為陰性(-)，總分為1～2分判定為弱陽性(+)，總分為3～4分判定為陽性(++)，總分在4分以上判定位強陽性(+++)。

1.3 觀察指標

(1)肺癌組織及癌旁組織中NapsinA、CGA、CK7的表達；(2)NapsinA、CGA、CK7表達與臨床病理的關系；(3)NapsinA、CGA、CK7表達與預后的關系。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 肺癌組織及癌旁組織中NapsinA、CGA、CK7的表達比較

NapsinA在肺癌組織中陽性率為62.39%，高于癌旁組織的21.10%(P<0.05)；CGA在肺癌組織中的陽性率為57.80%，高于癌旁組織中的27.52%(P<0.05)；CK7在肺癌組織中的陽性率為64.22%，高于癌旁組織的58.72%(P<0.05)。見表1及圖1。

表1 肺癌組織及癌旁正常組織中NapsinA、CGA、CK7的表達[n(%)]

2.2 NapsinA表達與臨床病理的關系

NapsinA表達與患者性別、年齡、有無吸煙史、治療方式和肺癌分化程度無關(P>0.05)；與病理類型、TNM分期和有無淋巴結轉移有關(P<0.05)；病理類型為肺腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴結轉移的患者肺組織內NapsinA陽性表達率越高。見表2。

表2 NapsinA表達與臨床病理的關系[n(%)]

2.3 CGA表達與臨床病理的關系

CGA表達與患者性別、年齡、有無吸煙史、治療方式、肺癌分化程度和淋巴結轉移無關(P>0.05)；與病理類型和TNM分期有關(P<0.05)；病理類型為大細胞癌、小細胞癌、TNM分期越晚的患者肺組織內CGA陽性表達率越高。見表3。

表3 CGA表達與臨床病理的關系[n(%)]

2.4 CK7表達與臨床病理的關系

CK7表達與患者性別、年齡、有無吸煙史、治療方式和肺癌分化程度無關(P>0.05)；與病理類型、TNM分期和有無淋巴結轉移有關(P<0.05)；病理類型為腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴結轉移的患者肺組織內CK7陽性表達率越高。見表4。

表4 CK7表達與臨床病理的關系[n(%)]

2.5 NapsinA、CGA、CK7表達與預后的關系

NapsinA陽性患者中位生存期為18個月，CGA陽性患者中位生存期為19個月，CK7陽性患者中位生存期為18個月，均低于NapsinA、CGA和CK7陰性的患者(P=0.001、0.001、0.003)。見圖2。

3 討論

NapsinA屬于天門冬氨酸水解蛋白酶家族中的一員，廣泛表達于II型肺泡表面上皮細胞和肺泡巨噬細胞表面[10]，通過其蛋白水解活性誘導肺表面活性蛋白的合成分泌，進而發揮維持肺形態和肺功能的作用[11]，已證實是肺腺癌診斷的特異性標志物[12]。CGA是酸性可溶蛋白的一種，由439個氨基酸分子組成，普遍存在于神經內分泌細胞致密核心顆粒中[13]，被廣泛用作神經內分泌的標志物[14]。CK7是堿性細胞角蛋白的一種，相對分子量約為54 kDa，廣泛存在于正常組織移行上皮及腺山溝細胞內，而在非上皮來源的細胞和組織中少量表達或不表達[15]，CK7既往常用于實體瘤轉移部位細胞來源的判斷和鑒別[16]。本研究中，肺癌組織NapsinA、CGA、CK7陽性表達高于癌旁組織(P<0.05)，原因可能在于隨著腫瘤進展的加劇，癌細胞不斷增殖、分化、發育，定位于細胞質中的NapsinA、CGA和CK7等腫瘤標記物的表達也隨之發生變化，NapsinA、CGA和CK7在肺癌細胞質中表達水平均隨著癌細胞的快速擴增而顯著增加，電鏡下表現出典型的棕黃色及深褐色顆粒狀染色，陽性細胞占比逐漸大，著色程度逐漸加深，表明NapsinA、CGA、CK7具有作為肺癌早期診斷腫瘤標志物的潛力，可將腫瘤組織和癌旁正常組織進行有效區分。本研究結果顯示，病理類型為肺腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴結轉移的患者肺組織內NapsinA陽性表達率越高；病理類型為大細胞癌、小細胞癌、TNM分期越晚的患者肺組織內CGA陽性表達率越高；病理類型為腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴結轉移的患者肺組織內CK7陽性表達率越高。推測原因可能與NapsinA、CK7和CGA自身特性有關，NapsinA和CK7普遍表達于肺腺癌細胞中，而在鱗癌、小細胞癌等其他類型的肺癌細胞中很少表達或幾乎不表達。CGA主要與神經內分泌腫瘤如大細胞癌、小細胞癌有關，在腺癌和鱗癌中幾乎不表達[17]，造成不同病理類型的肺癌患者NapsinA、CK7和CGA陽性率不同，表明NapsinA、CK7和CGA對肺癌病理類型的鑒別作用較好。而腫瘤分期越晚、存在淋巴結轉移的患者肺癌進展越快，腫瘤細胞增殖加快，定位于肺癌細胞質中的NapsinA、CK7和CGA陽性率隨之增加，最終導致NapsinA、CK7和CGA陽性率與病理類型、TNM分期和淋巴轉移均高度相關。此外，本研究結果還發現，NapsinA、CGA和CK7陽性患者中位生存期均低于NapsinA、CGA和CK7陰性的患者(P<0.05)。TNM分期越晚，腫瘤浸潤越嚴重，出現淋巴結轉移和遠處轉移的可能性更高，肺癌惡性程度也隨之增加[18]，導致NapsinA、CGA和CK7陽性患者生存期更短，預后明顯低于陰性患者[19]。提示NapsinA、CGA和CK7陽性率不僅與患者的病理類型、TNM分期和淋巴結轉移有關，還可以作為預測患者預后的有效分子，對于早期篩查以及預后評估均具有較好的價值，可能與NapsinA、CGA和CK7分子影響癌細胞增殖、凋亡等細胞周期的調控機制有關。NapsinA、CGA和CK7陽性表達增加不僅可影響肺癌細胞的適應能力，導致癌細胞增殖加快，增加其粘附能力，還通過刺激細胞內相關轉錄因子的表達誘導局部氧化應激損傷，介導癌細胞凋亡抑制，最終加速肺癌進展[20]，影響患者預后。

綜上所述，與癌旁正常組織相比，肺癌組織中NapsinA、CGA、CK7陽性率更高，且陽性患者預后較陰性患者更差，與患者病理類型、TNM分期及淋巴結轉移與否有關，臨床可加強對肺癌患者組織中NapsinA、CGA和CK7表達的監測，以提高肺癌的檢出率，評估預后。