基于網絡藥理學和分子對接探究麻黃加術湯治療類風濕關節炎的潛在作用機制

李曉麗, 應天昊, 唐一迪, 祝璇, 孫萌萌, 余濤, 趙佳寧, 張雷明

(煙臺大學 藥學院 分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室，山東 煙臺 264005)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜過度增殖和炎癥細胞浸潤為特征的慢性炎癥性關節疾病，會導致進行性關節損傷，甚至殘疾，嚴重影響患者的生活質量，給社會和家庭帶來沉重的負擔[1-2]。全球RA的平均患病率約為0.5%～1.0%[3-4]，可出現在任何年齡段，以老齡和女性居多。在我國，隨著人口老齡化加重，RA患者人數也在逐年增多[5]。然而，RA的發病機制復雜，治療通常是以緩解癥狀來提高患者生活質量。

目前，臨床治療RA的藥物主要有非甾體抗炎藥、糖皮質激素、改善病情抗風濕藥、免疫抑制劑和生物制劑，在一定程度上都可緩解病癥，但長期使用會產生不同程度的不良反應，患者依從性低[6-7]。RA在中醫中屬于“痹癥”“尫痹”“歷節”范疇[8-9]。在《金匱要略·痙濕暍病脈證治第二》中，麻黃加術湯是主治“濕家身煩疼”的重要方劑，其由麻黃、桂枝、甘草、杏仁、白術五味中藥配伍而成[10]。麻黃辛溫散寒、利水消腫，甘草補中益氣，桂枝溫經通脈，白術除濕，杏仁利氣祛濕[11-12]。張仲景在《金匱要略》中指出“麻黃加術，則雖發汗不至多汗，而術得麻黃，并可行表里之濕下趨水道，又兩相維持也”[13]。有研究表明，麻黃加術湯可能通過降低IL-1β、TNF-α水平，抑制炎癥細胞浸潤和纖維組織增生從而發揮治療作用[14]。同時，麻黃加術湯還可以降低RA患者體內T細胞亞群平衡來調節患者的免疫功能[15]。然而，對于麻黃加術湯在RA治療中的主要藥效成分和作用機制尚不明確，而中藥中的化學成分可以通過作用于機體內多個靶點來發揮治療作用，這也給中藥的研究帶來一定的挑戰。

近年來，隨著生物信息學技術的迅猛發展，網絡藥理學可以從整體上探索藥物與疾病的相關性，是從系統上揭示中藥分子機制的重要手段[16]。因此，本文通過網絡藥理學和分子對接的方法，對麻黃加術湯治療RA的有效成分、靶點和作用機制進行預測和分析。

1 材料與方法

1.1 麻黃加術湯活性成分和靶點獲取

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，獲取麻黃加術湯中麻黃、桂枝、甘草、杏仁和白術5種中藥的化學成分，以藥動學(absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME)參數[17](口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18)為條件進行篩選，共得到131個活性成分。通過Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載活性成分的SDF結構文件，上傳至Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中檢索靶點，按P>0.5篩選后即得到活性成分作用靶點。通過Uniport數據庫對靶點進行標準化處理。

1.2 RA潛在靶點獲取

在GeneCards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)和在線人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(https://www.omim.org/)數據庫中，以 “Rheumatoid Arthritis” 為關鍵詞進行檢索，去除重復值，整理疾病靶點并與活性成分靶點取交集，得到麻黃加術湯治療RA的潛在靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作網絡的構建

將1.2項獲取的潛在靶點上傳至STRING(https://string-db.org/)平臺，限定物種為“人”，最低相互作用閾值設為“medium confidence”(0.7)，將結果文件導入Cytoscape 3.7.1軟件構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡并對結果進行可視化分析。

1.4 活性成分-靶點-通路網絡構建

構建活性成分-靶點-通路的Network和Type文件，并將其導入Cytoscape 3.7.1軟件中，構建麻黃加術湯活性成分-類風濕關節炎靶點-作用通路網絡圖。

1.5 基因本體分析和京都基因與基因組百科全書通路富集分析

將潛在靶點導入Metascape(http://metascape.org/gp/)數據庫，Input as species和Analysis as species都設置為Homo sapiens，將閾值設定為P<0.05，進行基因本體(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，并進行可視化處理，分析麻黃加術湯治療RA的可能作用機制。

1.6 分子對接

通過Pubchem網站檢索獲取1.3項結果中排名前12名的關鍵化合物的SDF結構文件，并通過Open Babel 2.3.2軟件將所選化合物的SDF結構文件轉化為PDB文件，從Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)數據庫中檢索獲得靶點蛋白PDBID。用AutoDockTools軟件對受體蛋白進行修飾并轉化為pdbqt格式。以麻黃加術湯中關鍵化合物為配體，RA和麻黃加術湯共同作用靶點為受體，利用AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接，得到結合能打分，作為評價指標對結果進行分析，這種結合能是衡量配體是否能與受體分子有效結合的重要指標。

2 結果與分析

2.1 麻黃加術湯活性成分獲取

通過TCMSP數據庫，以OB≥30% 和 DL≥0.18 為標準進行篩選，得到麻黃加術湯中的活性成分共131個，其中麻黃23個、桂枝8個、甘草92個、杏仁19個、白術7個，麻黃與桂枝共有成分2個，麻黃與甘草共有成分3個，麻黃與杏仁共有成分1個，甘草與杏仁共有成分6個，麻黃、桂枝與杏仁共有成分1個，桂枝、甘草與杏仁共有成分1個。根據OB值排序，列舉出排名前20的成分，如表1所示。

表1 麻黃加術湯中OB值排名前20的活性成分Table 1 Active ingredients of Mahuangjiazhu Decoction by OB value (top 20)

表1(續)

2.2 RA潛在靶點獲取

將2.1項中獲取的活性成分導入SwissTargetPrediction數據庫并對結果進行處理后，得到342個成分相關靶點。通過GeneCards、OMIM和Drugbank數據庫共得到RA靶點1 165個。兩者取交集后獲得麻黃加術湯治療RA的潛在靶點133個。

2.3 靶點PPI網絡構建分析

潛在靶點的PPI網絡圖中包括126個節點、1 956條邊，見圖1。節點大小和顏色表示該節點度值的大小，節點越大、橙色越深，對應的度值越大。邊的不同顏色和粗細代表不同的結合分數，邊越粗、顏色越藍，結合分數越大。根據網絡拓撲學參數，以度值≥35為條件進行篩選，共得到22個核心靶點IL-6、TNF、TP53、STAT3、AKT1、VEGFA、CXCL8、JUN、MAPK8、MAPK1、IL-1β、MMP9、EGF、EGFR、PTGS2、CCL2、RELA、APP、ICAM1、MYC、IL-10、SRC，見表2，提示這些靶點蛋白可能在麻黃加術湯抗RA中發揮關鍵作用。

圖1 潛在靶點PPI網絡Fig.1 PPI network of potential targets

表2 核心靶點信息

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

將麻黃加術湯治療RA的潛在靶點進行GO富集分析，得到GO條目2 283個，其中生物過程(biological process，BP)2 250條、細胞成分(cellular component，CC)89條和分子功能(molecular function，MF)152條。與BP相關的主要有對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應、對無機物的反應等；與CC相關的主要有膜筏、膜微區、膜區等；與MF相關的主要有細胞因子受體結合、受體調節活性、細胞因子活性等。根據P<0.05選擇 BP、CC和MF富集較高的前10個進行可視化并生成柱狀圖，見圖2。

圖2 麻黃加術湯治療類風濕關節炎靶點的GO富集分析(排名前10)Fig.2 GO enrichment analysis of Mahuangjiazhu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis (top 10)

通過Metascape數據庫對麻黃加術湯治療RA的潛在靶點進行 KEGG 通路富集分析(P<0.05)，選取前20條通路，見圖3。如圖所示，這些潛在靶點主要富集在糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、癌癥信號通路、血流剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、TNF信號通路、乙型肝炎、恰加斯病(美洲錐蟲病)、C型肝炎、麻疹等信號通路。

圖3 麻黃加術湯治療類風濕關節炎的KEGG通路分析(排名前20)Fig.3 KEGG enrichment analysis of Mahuangjiazhu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis (top 20)

2.5 藥物成分-靶點-通路網絡

由于潛在靶點較多，所以將篩選出的核心靶點構建麻黃加術湯活性成分-類風濕關節炎靶點-作用通路網絡，見圖4。其中，度值較大的成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、甘草查爾酮A、刺芒柄花素等，均與多個靶點連接。度值較大的靶點包括PTGS2、MAPK1、JUN、RELA、MAPK8等。度值較大的通路涉及了糖尿病并發癥中的AGE-RAGE、癌癥信號通路、血流剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染等信號通路。

注：圖中紅色代表復方名，綠色代表中藥名(以拼音首字母代表)，紫色代表核心靶點，黃色代表麻黃加術湯活性成分，藍色代表作用通路。圖4 藥物成分-靶點-通路網絡圖Fig.4 Network of drug ingredients-targets-pathways

2.6 分子對接

選取PPI網絡中度值排名靠前的10個疾病相關靶點蛋白(AKT1、PTGS2、MAPK1、MAPK8、RELA、STAT3、CXCL8、IL-1β、IL-6、TNF)，分別與藥物成分-靶點-通路網絡中排名前12的活性成分進行分子對接，結果見表3。配體與受體結合性越好，結合能越低，一般結合能≤-5.0 kJ/mol 表明有較好的結合活性[18]。麻黃加術湯中的藥物活性成分與RA關鍵核心靶點對接分數均小于-5.0 kJ/mol，表明麻黃加術湯中的活性成分能較好地與RA相關靶點結合，潛在生物活性高。其中AKT1與PTGS2靶點與12種活性成分結合能力較好，表明二者具有較好的結合能力，潛在生物活性高。

表3 活性成分與PPI網絡排名前10靶點的對接結果Table 3 Docking results of compounds in Mahuangjiazhu Decoction with top 10 targets sequencing in protein-protein interaction network

以對接結果最好的AKT1與Phaseol為例，采用分子對接的方法研究受體蛋白AKT1與Phaseol配體小分子之間的結合模式。圖5為受體蛋白AKT1與Phaseol配體小分子之間的結合模式，氨基酸殘基Ile290、Thr211與Phaseol配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Gln79、Trp80、Asp292、Thr291、Leu210、Tyr272、Leu264、Val270、Lys268與Phaseol配體小分子形成疏水相互作用。

圖5 AKT1和Phaseol的分子對接圖Fig.5 Molecular docking diagram of Phaseol and AKT1

3 討論

近年來，中醫治療RA受到越來越多人的關注。中醫認為，正氣不足、氣血兩虛是RA的發病基礎[19]。麻黃加術湯是濕法治療RA的重要方劑，麻黃配伍白術，不僅能達到微微發汗的最佳程度，還能適當通利小便，達到內外除濕的功效[13]。在RA的臨床治療中，麻黃加術湯也可顯著改善患者的關節功能，患者關節腫痛、麻木、腫脹等癥狀得到明顯緩解，并且降低了不良反應和疾病復發率[20-21]。本文采用網絡藥理學的方法探討麻黃加術湯治療RA的潛在分子機制。

本研究通過對麻黃加術湯的初步篩選得到131個活性成分和1 165個RA治療靶點，通過Venn圖和PPI網絡圖得到交集靶點133個和藥物活性成分與交集靶點結合的度值排名，得到與RA關系密切的核心蛋白，包括AKT1、IL-6、TNF、STAT3、VEGFA、MAPK8等。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過多種機制調節軟骨細胞凋亡，影響關節炎病情的發展[22-25]。有研究證明，AKT1可以通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-3-kinases/ protein kinase B/ mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR)信號通路抑制RA大鼠的軟骨細胞增殖，并促進細胞凋亡和自噬[26]。IL-6是主要的炎性細胞因子，能夠促進大鼠滑膜成纖維細胞(FLS)中基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-9的表達，促進成骨細胞分化，造成機體內成骨細胞與破骨細胞紊亂失衡，影響RA炎癥反應進展[27-28]。TNF可以刺激滑膜內破骨細胞產生，加劇骨損傷[29]。此外，TNF還可以誘導FLS增殖，刺激FLS中IL-1β、MMP-3的表達，進而破壞關節軟骨，導致RA炎癥反應進展[30-31]。綜上所述，麻黃加術湯的有效成分可能通過調控AKT1、IL-6、TNF、STAT3、VEGFA、MAPK8等靶點來發揮治療RA的作用。

通過GO富集分析得到了麻黃加術湯影響的生物過程包括對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應、對無機物的反應等多個生物學過程，并通過 KEGG 對藥物影響的疾病通路進行富集，結果顯示其對AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、 TNF信號通路和Toll 樣受體信號通路等有調控作用。有研究表明，AGE-RAGE可以刺激促炎因子的產生，同時，還可以充當炎癥因子來激活先天免疫細胞，進一步導致關節炎的發展[32-33]。IL-17信號通路和TNF信號通路可以介導RA炎癥反應，參與RA相關的破骨細胞、軟骨細胞和滑膜細胞等的功能調節，刺激炎癥細胞因子的產生，導致滑膜增殖、血管增生[34]。Toll 樣受體信號通路的激活也可以誘導炎癥因子的產生、FLS增殖以及中性粒細胞募集進而導致軟骨破壞和關節損傷[35-36]。由此可推測，麻黃加術湯可能通過調節多種信號通路進而影響細胞凋亡、增殖和炎癥反應來發揮治療RA的作用。

本研究利用網絡藥理學及分子對接的方法對麻黃加術湯治療RA的機制進行探討，在藥物成分-靶點-通路網絡圖中對麻黃加術湯治療RA的關鍵活性成分進行篩選。分子對接結果顯示，核心有效成分與核心靶點的結合能均≤-5 kJ/mol，說明成分與靶點的結合能力較好，其中槲皮素、木犀草素、山奈酚的度值排名靠前，提示其在麻黃加術湯治療RA中發揮的作用最大。有研究表明，槲皮素可以抑制RA小鼠體內中性粒細胞浸潤，降低細胞中炎癥因子水平，同時還能促進活化的中性粒細胞凋亡，進而發揮治療RA的作用[37]。木犀草素可以抑制RA大鼠FLS增殖，同時也能降低MMP-1和MMP-3的分泌，通過抑制絲裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路和PI3K/Akt信號通路來達到治療RA的目的[38]。山奈酚可以通過抑制MAPK通路來減少FLS遷移、肌動蛋白細胞骨架重組以及MMP的表達而發揮治療RA作用[39]。槲皮素、木犀草素、山奈酚等成分能與RA的核心靶點結合較好，說明其可能是麻黃加術湯治療RA的關鍵成分。

綜上所述，麻黃加術湯可能是通過槲皮素、木犀草素、山奈酚等關鍵成分調節AKT1、IL-6、TNF等靶點以及AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路進而抑制機體炎癥反應，發揮治療RA的作用。本研究初步預測了麻黃加術湯治療RA可能的作用機制，對于研究結果仍需要后續的實驗予以驗證。