氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)測定大米中25種農藥及其代謝物殘留

張 蕊， 朱 琳， 李樂樂， 王松雪， 張 冰， 葉 金， 郭寶元

(國家糧食和物資儲備局科學研究院1，北京 100037)(呂梁學院2，呂梁 033099)

水稻是我國三大糧食作物之一，2019年我國稻谷總產量達20 961.4萬t[1]。據統計，我國稻谷約85%用于大米加工，多作為口糧直接食用[2]。水稻種植過程中，為了降低病蟲害的影響，農藥必不可少。伴隨著化學農藥的應用，不可避免地產生了農藥殘留問題，尤其是不科學、不規范的用藥給糧食質量安全帶來了巨大風險隱患[3]。大米中的農藥殘留主要來源于水稻生產中使用的化學農藥，雖然加工可以減少大米中農藥殘留水平，但大米中農藥殘留風險依然存在。為保護消費者健康，食品安全國家標準GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》對大米中的農藥殘留做出了明確的規定[4]。

有關大米中農殘檢測技術研究國內外均有報道[5-11]。檢測方法主要有高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]、液質聯用法[7-9]和氣質聯用法[10-14]。由于三重四極桿質譜法具有檢測下限更低、靈敏度更高的優點，在農殘分析中氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)得到了廣泛的應用。目前大米中農殘檢測GC-MS/MS法研究報道不少，但針對于GB 2763—2019中大米限定的農殘分析研究還很少，關于保護劑在大米中農殘檢測的應用研究很少。現基于GC-MS/MS法的農殘分析國家標準僅一項[13]，且需要溶劑轉化，存在耗時、容易損失農殘目標物等問題。本研究立足于國家食品安全標準GB 2763—2019，以大米中25種農藥及其代謝物殘留為檢測對象，深入探討了保護劑對基質效應的影響，建立一種基于氣相色譜-串聯質譜法檢測大米中多農藥殘留的快速方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：大米。

實驗耗材：乙腈(色譜純)；乙酸(色譜純)；乙酸乙酯(色譜純)；蒸餾水；PSA；C18(40～60 μm)；無水硫酸鎂(分析純)；氯化鈉(分析純)；50 mL和15mL離心管；0.2 μm濾膜；L-古洛糖酸內酯(分析純)；D-山梨醇(分析純)。

標準品: 丙草胺、稻豐散、稻瘟靈、敵稗、敵瘟磷、丁草胺、氟酰胺、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、甲奈威、喹硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、異丙威、艾氏劑、p,p’-滴滴涕、p,p’-滴滴涕、p,p′-滴滴伊、p,p′-滴滴滴、狄氏劑、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、七氯、禾草敵、氯蟲苯甲酰胺、氯氰菊酯、三唑磷、溴氰菊酯、順-氯丹、反-氯丹，濃度均為1 000 μg/mL；外環氧七氯B，質量濃度為100 μg/mL。

1.2 儀器與設備

TSQ 8000氣相色譜三重四極質譜聯用儀，5810R離心機，TARGIN VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器。

1.3 保護劑配制

配制含20 mg/mLL-古洛糖酸內酯以及10mg/mLD-山梨醇混合溶液。

1.4 標準溶液的配制

內標溶液：配制5 mg/L外環氧七氯B內標溶液。

農藥混標：配制25種農藥及其代謝物混合標準的儲備液，于-20 ℃保存。使用大米基質空白液將儲備液逐級稀釋為2.5、5、10、50、100 μg/L標準工作溶液。

基質匹配標準工作上機液：移取上述各濃度標準工作溶液1 mL，加入20 μL內標溶液，渦旋混勻后，再從中移取500 μL，加入20 μL保護劑，備用。

1.5 樣品處理

樣品經粉碎過20目篩后，準確稱取5.00 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合溶劑，渦旋搖勻20 min，以7 000 r/min離心5 min使固液分離。轉移10 mL上清液于50 mL離心管中，加入2.0 g無水硫酸鎂和0.8 g氯化鈉，振搖后，再次渦旋5 min，7 000 r/min離心5 min。待凈化。

移取上清液2 mL于裝有300 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg C18的15 mL離心管中，振搖后渦旋混勻5 min，7 000 r/min離心5 min，取上清液過0.2 μm濾膜。

移取1 mL上述凈化液，加入20 μL內標溶液，渦旋混勻，再從中移取500 μL，加入20 μL保護劑。

1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件

色譜柱：(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷石英毛細管柱；30 m×0.25 mm×0.25 μm；

色譜柱溫度：50 ℃，保持1 min，以50 ℃/min升溫至120 ℃，以4 ℃/min升溫至240 ℃，以12 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL/min;進樣口溫度：280 ℃；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣。

1.6.2 質譜條件

25種農藥及其代謝物和內標化合物的質譜條件為電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度：280 ℃。多反應監測：每種農藥分別選擇一對定量離子、一對定性離子。每種農藥的保留時間、定量離子對、定性離子對和碰撞電壓，見表1。

表1 25種農藥及其代謝物和內標化合物的質譜條件

2 結果與分析

2.1 儀器條件的選擇

25種農藥及其代謝物、內標化合物的沸點各不相同，如果采用恒溫色譜分析，低沸點組分因柱溫太高很快流出，峰形非常尖銳，而高沸點組分因柱溫太低和區域擴散，峰形扁平，影響準確定量，因此本實驗采用程序升溫。為方便用戶使用，本實驗選擇了最常見的HP-5MS弱極性色譜柱，而未選擇GB 23200.113—2018推薦的中等極性色譜柱[13]。

實驗中通過儀器SRM優化軟件，確定了25種農藥及其代謝物、內標化合物的母離子、子離子以及碰撞能，并選擇響應高、干擾小的離子對作為定量離子對，另一對作為定性離子對，見表1。一般氣質離子源溫度設置在200～300 ℃之間，隨著離子源溫度提高，離子化效率提升，靈敏度增加，特別是沸點高的物質。實驗中使用100 μg/L 混標，采用SRM模式，考察了不同離子源溫度(260、280、300 ℃)對25種農藥及其代謝物、內標化合物響應的影響。在每個離子源溫度下重復進樣4次，計算各自相對標準偏差，同時不同溫度下質譜峰響應平均值與300 ℃下質譜峰響應平均值比較，結果見圖1、圖2。從圖1、圖2可以看出，離子源溫度在260～300 ℃范圍內時，α-六六六及其異構體、三唑磷、丙草胺、喹硫磷、氟酰胺、氯氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺、溴氰菊酯隨著離子源溫度升高，靈敏度呈增加趨勢；外環氧七氯B、七氯、敵稗、禾草敵隨著離子源溫度升高，靈敏度呈下降趨勢。總體上離子源溫度280 ℃略優于300 ℃，但兩者響應差距不顯著，部分農藥在離子源溫度260 ℃下響應降低明顯，離子化效率低。GB 23200.113—2018中離子源溫度設定為280 ℃，但本實驗考慮到離子源在高溫下不易臟，最終將離子源溫度設定為300 ℃。

2.2 農殘前處理方法的優化

提取是農藥殘留檢測很關鍵的一步，對檢測結果有著直接的影響。乙腈的溶解性好，滲透力強，適合的農藥極性范圍相對廣泛，乙腈適當酸化，能促進農藥從組織中溶出，改善提取效率[15]。本研究采用20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合液直接提取樣品[16]，渦旋20 min后離心。

提取上清液中含有大量水分，無法直接進行氣質分析，必須將水分除掉。鹽析能減少有機溶劑在水中的溶解度，使提取液中的水分含量減少。目前國家標準GB 23200.113—2018中鹽包使用量大，鹽析發熱明顯，如操作不當，會造成局部過熱，甚至燙傷。因此本研究對前處理進行優化，選擇了2.0 g無水硫酸鎂和0.8 g氯化鈉作為鹽析劑，加入過程中不會造成局部過熱，除水效果理想。鹽析劑可實驗室自行配制，操作簡單，降低檢測成本。

在鹽析液中存在少量蛋白、脂肪等雜質，干擾后續分析，因此需要進一步凈化。常用的吸附填料有PSA、C18、石墨化碳黑GCB等。PSA可以有效去除脂肪酸、蛋白質等極性干擾物質；C18凈化劑可去除脂類、蠟類等非極性干擾物質；GCB表面由6個碳原子構成平面六角形，能有效吸附色素。大米中基本不存在色素干擾，因此選用PSA和C18作為凈化劑，同時加入一定量的無水硫酸鎂吸附鹽析液中殘留的少量水分。本研究中凈化劑比例參考GB 23200.113—2018添加。

圖1 不同離子源溫度下響應值比值

圖2 不同離子源溫度下響應值的相對標準偏差

GB 23200.113—2018凈化后需進行溶劑轉化，將溶劑乙腈轉化為乙酸乙酯，再進行氣質分析。考慮到溶劑轉化過程存在耗時、容易損失農殘目標物的缺點，且目前很多品牌的色譜柱可耐受乙腈， 因此本研究采用凈化后直接進樣。整個前處理過程操作簡便、快速、可實現批量處理。

2.3 方法學驗證

2.3.1 保護劑對基質效應的影響

基質效應(matrix effect，ME)是指樣品中除分析物以外的組分對分析物的離子化產生增強或抑制作用，影響分析結果的準確性[17]。目前基質效應評價方式主要有兩種，一種是基于目標物響應值(峰面積)，即基質中目標物響應值與純溶劑中目標物響應值的比值[17]；一種是基于標準曲線斜率，即基質匹配標準曲線斜率與純溶劑配制標準曲線斜率的比值[18]。兩種方法的計算理論依據一致，表述方式略有不同。實驗中對兩種評價方式進行了比較。方法一采用100 μg/L純溶劑(乙腈)標液及基質標液，方法二采用2.5～100 μg/kg線性范圍內的基質匹配標準曲線斜率與純溶劑配制標準曲線斜率(外標法)，大米中25種農殘及其代謝物的基質效應結果見圖3。可以看出，基質對所有農藥有明顯增強作用，與文獻報導在氣相色譜中主要表現為基質增強效應結論一致[14]。在氣相色譜中，基質成分的存在減少了色譜系統活性位點與待測物分子作用的機會，使得待測物的檢測信號增強[14]。除δ-六六六、γ-六六六2種農藥略有差距外，其他農藥兩種基質效應評價方式結果具有很好的一致性。標準曲線通過多點線性回歸獲得，因此，標準曲線斜率比值比單點響應值比值具有更強的穩健性。

一種比較常見的補償基質效應的方法是加入分析保護劑。分析保護劑可以與待分析農藥競爭襯管中的活性位點，也可降低高溫不穩定的農藥在進樣口的分解率，從而提高純溶劑中農藥標準品的響應值，達到與基質中農藥同等的響應[19]。實驗中考察了L-古洛糖酸內酯和D-山梨醇保護劑對響應的影響。分別配制了100 μg/L純溶劑(乙腈)標液、基質標液、含保護劑的溶劑標液、含保護劑的基質標液四種標液。不同標液中農藥的響應值與含保護劑的溶劑標液中相應農藥的響應值比較，見圖4。保護劑的加入對于純溶劑中多數農藥(除氯蟲苯甲酰胺外)有顯著增強效應，特別是甲萘威。狄氏劑、順-氯丹、反-氯丹3種農藥受基質影響不大。丁草胺、丙草胺、喹硫磷、敵稗、氟酰胺、氯蟲苯甲酰胺等農藥含保護劑的溶劑標液與基質標液響應差距顯著，因此用含保護劑的溶劑標液作為定量標準曲線并不合適。對于大米中多數農藥(丁草胺、敵瘟磷、氟酰胺、溴氰菊酯、甲萘威除外)，當純溶劑標液和基質標液中加入相同量的保護劑，可以補償純溶液基質效應，削弱基質溶液的基質效應。因此，在實際測定過程，可采取基質標曲或是保護劑基質標曲作為樣品定量標曲。

圖4 保護劑對響應值影響的對比

2.3.2 線性范圍

為了提高方法的準確性，降低基質效應的影響，本實驗采用保護劑基質匹配內標曲線進行定量。在2.5～100 μg/kg范圍內，大米中25種農殘及其代謝物線性良好，R2≥0.995，可用于定量，見表2。

表2 大米中25種農殘及其代謝物的標準曲線

續表2

2.3.3 加標回收率、定量限及檢出限

取空白大米樣品，分別添加不同濃度的混合標準溶液，獲得10、20、100、200 μg/kg添加水平樣品，每個加標水平進行3平行實驗，計算各添加水平下的回收率及相對標準偏差，見表3。在10 μg/kg添加水平下，各農藥回收率67.2%～95.6%，相對標準偏差0.9%～18.2%；在20 μg/kg添加水平下，各農藥回收率73.7%～95.6%，相對標準偏差0.6%～12.2%；在100 μg/kg添加水平下，各農藥回收率83.0%～101.4%，相對標準偏差0.3%～8.4%；在200 μg/kg添加水平，各農藥回收率90.2%～111.3%，相對標準偏差0.2%～3.3%。除殺螟硫磷在200 μg/kg回收率(111.3%)略高于GB/T 27404—2008[20]要求(0.2 mg/kg添加水平，80%～110%)外，其他農藥在10～200 μg/kg添加水平下，均符合公告要求。該方法各農藥定量為0.01 mg/kg，檢出限小于0.001 mg/kg，能滿足GB 2763—2019中大米中農藥限量檢測的要求，可應用于大米中限量農殘的日常檢測工作中。

表3 大米中25種農殘及其代謝物加標回收率

2.4 大米實際樣品的測定

采用開發的保護劑基質內標方法(GC-MS/MS)對15個市售的大米樣品進行測試分析，農殘檢測結果見表4。除稻瘟靈、甲基嘧啶磷、三唑磷外，其他限量農殘留均未檢出，檢出值遠低于限量標準(GB 2763—2019)。

表4 市售大米樣品中25種農殘及其代謝物的測定

3 結論

基于氣相色譜-三重四極桿質譜(GC-MS/MS)技術，建立了同時檢測大米中25種農藥及其代謝物殘留的方法，樣品經提取、鹽析、凈化，加保護劑，上機測定，操作簡單，可批量處理，準確度和精密度滿足方法學要求，方法的定量限低于食品安全標準大米中農藥最大殘留限量的要求，適用于批量大米樣品中農藥殘留的日常定量分析，為保障我國大米質量安全提供參考。