液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質譜同時測定糧油中77種真菌毒素

袁光蔚， 莫紫梅， 周嵩煜， 戴向東， 葉 金，吳 宇， 伍先紹， 胡 蓉， 王海波

(廣西-東盟食品檢驗檢測中心1, 南寧 530029) (國家糧食和物資儲備局科學研究院2,北京 100037) (廣西壯族自治區(qū)糧油質量檢驗中心3,南寧 530031)

真菌毒素為真菌生長繁殖過程中產生的毒性次級代謝產物[1]。目前，已確認化學結構的真菌毒素有400多種[2]。研究表明，部分真菌毒素具有致畸、致癌、致突變、肝腎毒性、免疫毒性和神經毒性等危害[3]。近年來，受全球氣候變暖等因素的影響，世界各國的真菌毒素侵染事件屢見報端，特別是農產品中多種真菌毒素協同污染現象頻頻發(fā)生，多種真菌毒素的檢測越來越受重視[4，5]。廣西為高溫高濕環(huán)境，非常適宜黃曲霉毒素等真菌毒素的繁殖，因此，對廣西地區(qū)主產糧油及其制品進行真菌毒素污染風險的監(jiān)測、評估及治理迫在眉睫。

真菌毒素的檢測方法主要有酶聯免疫法、膠體金快速檢測法、薄層層析法、熒光光度法、液相色譜法和高效液相色譜-質譜聯用法等。其中酶聯免疫法、膠體金快速檢測技術屬于快速檢測方法，具有簡單、快速、便捷的優(yōu)勢，但也存在著假陽性、假陰性的風險[6]；薄層層析法操作過程復雜，重復性較差，在檢測上的使用受到限制，一般只做定性或者粗略的定量實驗[7]；而熒光光度法、液相色譜法雖為當前的主流檢測方法，但其前處理較為復雜，對檢驗人員的操作技術要求較高，且免疫親和柱成本高，對多種毒素同時檢測的能力有限[8]；高效液相色譜-質譜聯用法兼具通用性和選擇性，靈敏度高，適合多組分毒素的同時檢測，但由于其為低分辨率質譜，不能提供精準的結構碎片信息，在分析復雜基質樣品時常常存在假陽性等問題，具有一定的局限性。

四極桿-靜電場軌道阱質譜將四極桿的高離子選擇性和靜電場軌道阱高分辨掃描技術有機結合，分辨率、靈敏度、抗干擾能力更強，卓越的定性能力基本避免了假陽性情況的發(fā)生，在真菌毒素分析領域中得到快速發(fā)展和應用：如Alfonso等[9，10]結合QuEChERS技術，檢測了梨汁中14種鐮刀菌屬真菌毒素及植物藥中16中霉菌毒素；胡巧茹等[11]通過含2%甲酸的乙腈萃取，Captive EMR-Lipid柱純化，對谷物產品中20種霉菌毒素進行了篩選和確認；Ellen等[12]開發(fā)了昆蟲中23種真菌毒素的檢測方法；Yelko等[13]建立用于同時測定大豆?jié)h堡中21種霉菌毒素和12種異黃酮的UHPLC-Q-Orbitrap HRMS方法等。但面對日益增長的真菌毒素監(jiān)測數量及日常監(jiān)管任務重、急、快的需求，仍然面臨著毒素檢測種類少，前處理耗時長等壓力。

本研究采用混合溶劑對樣品進行直接提取，然后稀釋、過濾，最后通過高分辨率質譜進行快速篩查、定量，以期滿足糧油產品中真菌毒素的日常監(jiān)管防控工作需要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇(色譜純)；甲酸(色譜純)；乙酸銨(色譜純)；77種真菌毒素混合標準儲備溶液(質量濃度為40～8 000 ng/mL)；15種真菌毒素同位素內標混合溶液(質量濃度為1～265 ng/mL)；植物油樣品(廣西各地市植物油抽檢樣品)。

Milli-Q 超純水系統，KS260振蕩儀，ROTANTA460/460R離心機，A-14C離心機，超高效液相-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜配H-ESIⅡ源、Ultimate 3000 液相色譜系統及TraceFinder4.1數據處理系統。

1.2 方法

1.2.1 樣品的前處理

固體樣品經粉碎，過40目篩后，混勻備用；液體樣品直接取樣使用。取5 g混勻的樣品，置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合提取溶液，振蕩提取15 min，4 600 r/min離心10 min，精密轉移0.70 mL上清液于2 mL離心管中，然后加入0.70 mL水稀釋，渦旋混勻1 min，在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，上清液經0.22 μm的PTFE濾膜過濾，取180 μL濾液和20 μL同位素內標混合儲備液于具有內插管的進樣小瓶內，混勻待測。

1.2.2 標準溶液的配制

按樣品的前處理方法處理3種不同基質的空白樣品，得空白基質濾液；取混合標準儲備液，用空白基質濾液將其逐級稀釋，配置成濃度比例為1∶2∶4∶10∶20的系列混合標準工作液，然后分別取180 μL系列混合標準工作液和20 μL同位素內標混合儲備液置于具有內插管的進樣小瓶內，混勻，即得系列濃度混合標準曲線溶液，濃度范圍見表1。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 液相色譜條件

Waters CORTECSTM ? UPLC ? C18柱(1.6 μm，100 mm × 2.1 mm)；流動相A為含0.1%(體積分數)的甲酸和1 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為甲醇。梯度洗脫條件：0～2 min，90% A；2～3 min，90% A～80% A；3～4 min，80% A～79% A；4～5 min，79% A～74% A；5～7 min，74% A；7～10.5 min，74% A～40% A；10.5～13.5 min，40% A；13.5～14.5 min，40% A～5% A；14.5～17 min，5% A；17～18 min，5% A～90% A；18～21 min，90% A；流速：0.3 mL/min，柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

1.2.3.2 質譜條件

掃描模式：正離子；噴霧電壓：3.20 kV；鞘氣流速：35 L/min；輔助氣流速：10 L/min，溫度：300 ℃；離子傳輸管溫度：320 ℃；采集模式：Full MS/dd MS2；一級質譜分辨率：70 000；掃描范圍：70～900m/z；二級質譜分辨率：17 500；觸發(fā)閾值：2.0e4；歸一化碰撞能：20、40、60。

1.3 數據處理

運用儀器自帶的TraceFinder 4.1數據處理系統及Mass Frontier 7.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇

當前，食品中真菌毒素的提取一般選擇甲醇、乙腈等與水的混合溶液作為提取溶劑。乙腈溶解性能優(yōu)良，對極性和非極性的真菌毒素均有較高的提取率，并能促使樣品中蛋白質變性沉淀，進一步提高提取效率[14]。部分真菌毒素對pH比較敏感，在提取溶劑中加入輔助試劑可提高聯合提取效果[11,14]。研究發(fā)現[15，16]，甲酸、乙酸等可提高諸如伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、赭曲霉素A、桔霉素、夫馬潔林等的提取回收率，如夫馬潔林為酸性化合物，當pH降低到一定程度，使其處于非解離狀態(tài)時，在玉米樣品中的回收率可高達80%。經過實驗優(yōu)化，選擇了以乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)為提取溶劑。

提取溶液一般選擇QuEChERS技術或多功能柱進行凈化。盡管凈化步驟確實純化了上機溶液，減少了雜質的影響，但也增加了實驗步驟，降低了整體效率。胡巧茹等[11]實驗表明，QuEChERS技術使用的乙二胺-N-丙基硅烷、石墨化炭黑等凈化劑，會吸附部分真菌毒素，導致回收率不夠理想；鄭翠梅等[17]在實驗中發(fā)現，使用Mycosep226凈化柱時，對伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、赭曲霉素A有較嚴重的吸附作用。本研究中，檢測的真菌毒素多達77種，它們結構各異，理化性質也不盡相同，為兼顧化合物的整體回收率，本實驗結合儀器本身抗污染、抗干擾能力強的特點，最終采取了直接提取，然后用純水進行稀釋的前處理方法。既簡化了實驗步驟，提高了檢驗效率，獲得了較滿意的回收率，又降低了溶劑效應的影響，利于獲得峰形良好的色譜峰。

2.2 液相條件的優(yōu)化

77種真菌毒素，極性各異，本實驗采用了Waters CORTECS ? UPLC ? UPLC C18(1.6 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱，其通用性較強，極小的粒徑使色譜柱具有極高的柱效，對多種化合物的分離具有較大的優(yōu)勢，較小的內徑和適中的長度既保證了柱容量，又兼顧了流動相的消耗。

常用的流動相中，甲醇的極性較乙腈強，洗脫能力相對較弱，可兼顧多化合物檢測的整體分離效果。

圖1 流動相中加甲酸前、后桔霉素的提取離子流圖

實驗發(fā)現，在標準溶液濃度相同的情況下，在流動相水相中加入了有機酸時，部分化合物的響應明顯增強了，應該是有機酸的存在促進了化合物的離子化效率，使響應增大，通過優(yōu)化有機酸的種類和濃度，選擇了在水相中加入0.1%(體積分數)甲酸。圖1為桔霉素在流動相中加入甲酸前、后的響應對比。同時發(fā)現，在流動相中加入一定濃度的乙酸銨時，可以提高部分化合物的響應和改善色譜峰形，應該是乙酸銨的加入為化合物的加合提供了NH4+的來源，也影響了其色譜行為，如圖2所示，水相中未加乙酸銨時，雙氫麥角汀的保留時間延后，且峰形明顯的分叉。

圖2 流動相中加乙酸銨前、后雙氫麥角汀的提取離子流圖

本次實驗選擇了含0.1%(體積分數)的甲酸、1 mmol/L乙酸銨的水溶液和甲醇溶液為流動相進行梯度洗脫，并考慮到降低溶劑效應及防止水相中的乙酸銨在高比例有機相中析出導致色譜柱堵，流動相初始梯度使用了較高比例的水相。

2.3 質譜條件的確定

通過對混合標準溶液進行全掃描模式采集，確定了各個化合物的最佳電離模式以及加合形式，詳見表1。優(yōu)化過程中發(fā)現，除脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物等為數不多的幾個化合物最佳電離模式為負離子模式外，其余皆為正離子模式，由于儀器的采集速度有限，為保證定量所需采集點數，本實驗中所有化合物皆采用正離子模式，以避免采集過程中正負模式切換導致采集點數不足的問題。采用Full MS/dd MS2采集模式對混合標準溶液進行數據采集，獲得了化合物的保留時間、母離子質荷比及二級質譜圖。利用Mass Frontier 7.0軟件推測各化合物可能的質譜轉換裂解途徑，結合實際采集的二級質譜圖，確認了其二級特征碎片離子，詳見表1。圖3為以黃曲霉毒素B1為例的質譜轉換裂解途徑。以分子式、子離子、保留時間等信息為基礎，建立了數據庫。由于本實驗檢測的化合物組分較多，通過數據庫的匹配篩查，再根據最終篩查結果有目的的進行定量，可有效降低工作量，提高數據處理效率。

圖3 黃曲霉毒素B1質譜轉換裂解途徑

表1 77種目標化合物的分子式、儲備液濃度和質譜參數

續(xù)表1

續(xù)表1

2.4 基質效應

ESI源中基質效應的產生是由于受共流出物質的干擾，產生競爭性電離，導致目標物響應增強或者降低的現象[18]。由于本實驗提取方法不經過凈化，樣品中會存在著一定的基質干擾，因此，本實驗分別對大米、小麥、植物油三類樣品的基質效應進行了考察，以目標物在空白基質液中的峰面積與在純溶劑中峰面積的百分比來評估基質效應，高于100%說明有基質增強效應，低于100%則說明有基質抑制效應。結果顯示，77種真菌毒素的基質效應為70.0%～206.0%，其中，90%～110%占71.86%，<80%及>120%的為總數的8.23%，說明化合物在這三種基質中存在一定的基質增強或抑制效應。如細交鏈孢菌酮酸在植物油基質中基質增強作用嚴重，達206.0%，而T-2四醇在大米基質中則存在較明顯的基質抑制效應，為70.0%，這可能是由于樣品提取液中的油脂以及磷脂類物質等影響了某些化合物的離子化效率導致的結果。

穩(wěn)定同位素稀釋法和基質加標曲線法是常見的降低基質效應的方法，其中穩(wěn)定同位素稀釋法是最有效的方法之一，但由于穩(wěn)定同位素內標的價格較為昂貴，且難以獲得，故本實驗僅對國家日常監(jiān)督中常見的15種真菌毒素采用了穩(wěn)定同位素稀釋法定量，但為了更好的降低基質效應的影響，確保結果的準確可靠，其余均采用基質加標曲線法。

2.5 方法的線性及范圍

系列濃度混合標準曲線溶液經高分辨率質譜檢測，以待測化合物的母離子峰面積(y)對其質量濃度(x)進行線性擬合，獲得各待測化合物的線性方程。77種化合物在各自濃度區(qū)間范圍內線性良好，變異系數R2均大于0.99。

2.6 檢出限、準確度和精密度

采用逐級稀釋加標樣品至儀器能檢出的最低含量為各化合物的儀器檢出限，經過換算得到其方法檢出限，并以方法檢出限的3倍量為方法定量限，為0.6～48.0 μg/kg。取大米、小麥、植物油空白樣品，進行了曲線最低點(低水平)、曲線第二低點(中水平)、曲線中間點(高水平)濃度水平的加標回收實驗，每個濃度水平測定6個平行樣品，對回收率進行了匯總統計，回收率在70.0%～120.0%的占95%以上；但桔霉素、細胞松馳素A在大米中的回收率僅為25%左右，嗜熱菌殺酵母素、桔霉素、細胞松馳素A在小麥中的回收率為45%左右，可能是由于這兩種基質所含淀粉、蛋白質較多，影響了它們的理化性質，從而導致其提取效果低下。對回收率精密度進行考察，RSD為0.1%～8.7%，說明方法具有良好的重復性。

2.7 實際樣品檢測

采用本實驗方法對來自廣西區(qū)內各地市的236批食用植物油樣品進行檢測，共檢出5種真菌毒素，均為小油坊花生油樣品，結果見表2。其中黃曲霉毒素B1和柄曲霉素的二級碎片離子見圖4、圖5。

圖4 黃曲霉毒素B1在實際樣品和標準溶液中的二級質譜圖

圖5 柄曲霉素在實際樣品和標準溶液中的二級質譜圖

黃曲霉毒素B1是植物油中常見的真菌毒素污染物，為自然界中理化性質最為穩(wěn)定的一類霉菌毒素，被國際癌癥研究機構確定為一級人類致癌物[19]。國家標準規(guī)定[20]，花生油中黃曲霉毒素B1限量為20 μg/kg，此次檢出量為0.62～1 861.15 μg/kg，表明部分樣品含量甚至達到了最大限值的90倍。這種情況的出現主要體現了生產者對真菌毒素危害性認知的缺失，以及小油坊儀器設備的局限。可見，對小油坊的日常監(jiān)管工作有待加強，需進一步引導生產者從源頭尋找、分析并避免引起真菌毒素超標的原因，特別是對原料進行嚴格的分揀、保證原料儲藏的溫濕度，并對生產設備進行日常的清潔、消毒；另一方面，也可以推廣各種經驗證有效、可行的降毒技術。

柄曲霉素最初分離于雜色曲霉培養(yǎng)物中，是黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素G1的合成前體，具有致癌性，被國際癌癥研究機構劃分為2B類致癌物[21]。我國現行國家標準中食品中雜色曲霉素的測定，僅適用于大米、玉米、小麥、黃豆及花生樣品[22]，此次植物油中柄曲霉素的檢出率為4.66%，含量為1.52～12.51 μg/kg，說明植物油中存在柄曲霉素的污染風險，有關部門需引起重視，必要時可對陽性樣品進行溯源研究，同時進行風險評估甚至制訂標準以填補監(jiān)管空白。這也充分說明了本實驗方法有利于發(fā)現糧油中真菌毒素污染情況的監(jiān)管漏洞，可為糧油中真菌毒素污染防控提供技術支持。

經考察，儀器連續(xù)進樣7 d，加標回收質控樣品保留時間無偏差，峰面積穩(wěn)定，且儀器污染程度較低，說明實驗方法穩(wěn)定性好，不會增加儀器的維護成本，可滿足大批量、長時間的進樣檢測。

表2 236批植物油的檢測結果匯總

3 結論

利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap)技術建立了一種直接提取、稀釋進樣，測定大米、小麥、植物油中77種真菌毒素的方法。本方法檢測數量多，前處理簡便高效。經方法學考察及實際樣品檢測證明，本方法實用性強，穩(wěn)定性好，效率高，可滿足國內外糧油中真菌毒素的高通量快速篩查和定量的要求。