211At及131I標(biāo)記尼妥珠單抗的荷瘤小鼠體內(nèi)治療研究

劉葳豪，馬 歡，李飛澤，李鴻巖，蘭 圖，廖家莉，秦 芝，劉 寧，楊遠(yuǎn)友

(1.四川大學(xué) 原子核科學(xué)技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064；2.中國科學(xué)院近代物理研究所，蘭州 730300；3.甘肅省同位素實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

靶向放射性核素治療(TRT)是一種新興的癌癥治療手段，可將核素靶向病灶，具有同時消除原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性癌癥的潛力，甚至是對傳統(tǒng)診斷成像檢測不到的病灶也同樣具有療效[1]。目前，放射性藥物對于腫瘤的靶向治療已經(jīng)顯示出巨大的潛力，除了用于甲狀腺癌治療的Na[131I]注射液以外，[223Ra]注射液(Xofigo)、177Lu-DOTATATE(LUTATHERA?)、90Y-Ibritumomab tiuxetan(90Y-替伊莫單抗)、177Lu-PSMA-617(Pluvicto)等放射性靶向治療藥物也先后批準(zhǔn)上市，并取得了良好的臨床效果[2-3]。

放射性治療藥物常利用α和β射線[4]，131I作為β治療最具代表的核素之一，半衰期為8.02 d，釋放γ射線可用于SPECT顯像，因而作為診治一體化核素，在科學(xué)研究和臨床治療中獲得廣泛應(yīng)用。1941年131I就被用于治療甲亢和甲狀腺癌[5]，Na131I也是最早通過FDA批準(zhǔn)上市的放射性藥物。近年來，131I標(biāo)記的芐基胍衍生物(131I-MIBG)在惡性嗜鉻細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤[6]、腎上腺腫瘤[7]的診斷和治療也展現(xiàn)出了巨大應(yīng)用潛力和臨床轉(zhuǎn)化價值。值得注意的是，131I的同鹵族元素中211At也是備受關(guān)注的治療核素，愈來愈多的研究表明，α核素更適合于散在性癌、微轉(zhuǎn)移癌和不適合手術(shù)或外照射治療的實(shí)體瘤及非實(shí)體腫瘤的治療[8-9]。211At半衰期7.21 h，有足夠長的時間進(jìn)行標(biāo)記，且同時與多種配合物的代謝周期相匹配[10-11]；其傳能線密度(LET)可達(dá)98.84 keV/μm，具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性[12]；電子捕獲衰變產(chǎn)生的能量為77～92 keV的X射線可用于211At和相關(guān)標(biāo)記藥物的質(zhì)量控制，或進(jìn)行SPECT顯像[13]。131I和211At同屬于放射性鹵素，具有相似的化學(xué)性質(zhì)，砹沒有穩(wěn)定的同位素，半衰期最長的為210At(T1/2=8.1 h)，211At的標(biāo)記研究大多以放射性碘(125I/131I)為基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的211At標(biāo)記方法也與碘的間標(biāo)類似，主要以鹵素脫金屬的親電取代反應(yīng)為主。但是211At相關(guān)的標(biāo)記藥物的實(shí)際應(yīng)用卻全面落后于131I，到目前為止，還沒有211At標(biāo)記藥物獲準(zhǔn)上市。

表皮生長因子受體(EGFR)在大多數(shù)實(shí)體腫瘤，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、膠質(zhì)瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等癌癥中過度表達(dá)[14-15]，被認(rèn)為是最為理想的腫瘤診斷和治療靶點(diǎn)之一。在眾多靶向EGFR的載體中，尼妥珠單抗(Nimotuzumab)是一種具有特異靶向性的全人源化單克隆抗體，已經(jīng)被用于多種惡性上皮腫瘤的臨床治療，并取得了十分積極的治療效果[16-17]。因此，基于Nimotuzumab的多種放射性標(biāo)記藥物也在近年來引發(fā)了廣泛關(guān)注[18-20]。在前期研究中，本課題組用正電子核素89Zr標(biāo)記的Nimotuzumab，成功進(jìn)行了荷U87MG膠質(zhì)瘤裸鼠的PET/CT成像[21]，充分證實(shí)了該載體具有良好的體內(nèi)靶向性和腫瘤滯留能力，從而有望用于TRT。

本文擬采用間接標(biāo)記法制備兩種放射性標(biāo)記藥物131I-Nimotuzumab和211At-ATE-nimotuzumab，并對兩種標(biāo)記藥物對荷U87MG膠質(zhì)瘤裸鼠的治療效果進(jìn)行考察，對比同族的兩種典型的核素治療效果，以評價211At標(biāo)記單克隆抗體在腦膠質(zhì)瘤放射性免疫治療中的潛力。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

尼妥珠單抗(nimotuzumab)：百泰生物藥業(yè)有限公司；N-琥珀酰亞胺-3-(三甲基錫基)苯甲酸酯：多倫多化學(xué)研究公司；碘代琥珀酰亞胺：薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；L-抗壞血酸鈉：大連美侖生物技術(shù)公司；PD-10脫鹽柱：美國GE Healthcare公司；Na131I：成都中核高通同位素公司；U87MG(膠質(zhì)瘤細(xì)胞)：BNCC北納生物公司；超濾管：德國Merck Millipore公司，10 kDa。

FH-603井型閃爍探頭,FH463A自動定標(biāo)器：北京核儀器廠；BS210S電子天平：德國Sartorius公司；恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；冷凍高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；CRC-15R放射性活度計(jì)：美國CAPINTEC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

68只Balb/c-nu裸鼠：(20±2) g，四周齡雌性，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照四川大學(xué)動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 131I-ATE-nimotuzumab的制備

取3 μL 0.013 mol(摩爾量控制在蛋白摩爾量10倍)溶于氯仿中的N-琥珀酰亞胺-3-(三甲基錫基)苯甲酸酯(m-Me ATE),氮?dú)獯蹈桑尤?0 μL DMSO重新溶解。再加入100 μL 50 mg/mL尼妥珠單抗，混勻。室溫反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，采用10 kDa的超濾管進(jìn)行離心(正甩1次，14 000 g，10 min；反甩1次，1 000 g，2 min)，以去除多余的偶聯(lián)劑ATE。

取適量131I加入5 μL 0.03 mg/mLN-碘代琥珀酰亞胺(NIS)，活化131I約1 min，探究不同量的免疫偶聯(lián)物ATE-mAb和不同的反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響。最后加入5 μL抗壞血酸鈉(2 mg/mL)去除NIS終止反應(yīng)(5倍摩爾過量于NIS)。通過放射性薄層色譜層析法(TLC)分析標(biāo)記率，展開劑體系為V(丙酮)∶V(水)=3∶1。標(biāo)記混合物PD-10凝膠柱分離。通過TLC分析放化純度，展開劑體系為V(丙酮)∶V(水)=3∶1。

2.2 211At制備

在四川大學(xué)CS-30回旋加速器上用28 MeV的15～20 mA的α粒子束轟擊鉍靶4 h，經(jīng)由209Bi(α,2n)211At反應(yīng)生成211At，通過蒸餾法制得211At[22]。

2.3 211At-ATE-nimotuzumab的制備

標(biāo)記方法與131I-ATE-nimotuzumab方法類似。取蛋白摩爾量10倍左右的m-Me ATE與尼妥珠單抗進(jìn)行偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后，采用超濾管進(jìn)行純化。在211At溶液中加入NIS，進(jìn)行活化標(biāo)記。再加入適量抗壞血酸鈉去除NIS終止反應(yīng)。通過TLC分析標(biāo)記率，展開劑體系為V(丙酮)∶V(水)=3∶1。

2.4 131I/211At-ATE-nimotuzumab體外穩(wěn)定性

取純化后的標(biāo)記藥物131I/211At-ATE-nimotuzumab分別置于不同介質(zhì)中：(1) 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.6)；(2) 胎牛血清(FBS)。室溫下放置。分別于0、3、6、12、24 h取樣，TLC分析不同時間點(diǎn)標(biāo)記物的放化純度，展開劑體系為V(丙酮)∶V(水)=3∶1。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)

U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞在添加10%FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗PEST的DMEM中培養(yǎng)。細(xì)胞在37 ℃，二氧化碳含量5%的濕度空氣培養(yǎng)箱里面生長傳代。

2.6 腫瘤模型的建立

取處于生長對數(shù)期的U87MG細(xì)胞，在四周齡的雌性裸鼠左側(cè)腋下皮下注射5.0×106個U87MG細(xì)胞，當(dāng)腫瘤長半徑達(dá)到5～8 mm(通常是接種后1至2周)時，進(jìn)行篩選，選用腫瘤約為100 mm3的荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)。所有涉及動物及其護(hù)理的實(shí)驗(yàn)程序均按照NIH指南進(jìn)行。

2.7 荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布

將20只荷U87MG瘤裸鼠隨機(jī)平均分為4組。每只荷瘤鼠通過瘤內(nèi)單點(diǎn)注射100 μCi(10 μL)131I-ATE-nimotuzumab。待注射完成后3、6、12、24 h分別處死一組裸鼠，并解剖取其心、肝、脾、肺、腎、腸、胃、肌肉、骨、血、腦、腫瘤和甲狀腺，稱重并用定標(biāo)器測各組織、器官的放射性計(jì)數(shù)。計(jì)算各組裸鼠器官組織的放射性攝取率(%ID/g)。組織的放射性攝取率(%ID/g)=[組織的計(jì)數(shù)/(注射藥物的計(jì)數(shù)×組織的質(zhì)量)]×100%。

2.8 荷瘤裸鼠的治療

當(dāng)荷瘤小鼠的腫瘤約為100 mm3時，每組6只小鼠通過瘤內(nèi)單點(diǎn)注射100、200 μCi的131I-ATE-nimotuzumab；10、20 μCi的211At-ATE-nimotuzumab，對照小鼠分別注射相同體積的生理鹽水，200 μCi131I或20 μCi211At溶液。隔天記錄每只荷瘤小鼠腫瘤體積大小(長×寬=2 mm×0.5 mm)，同時記錄各組裸鼠的體重。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到15 mm，或者體重與正常體重相比減少量超過了20%，再或者觀察到小鼠的身體健康受到明顯影響，則用異氟烷麻醉小鼠后脫頸處死。解剖小鼠，將組織樣品如小鼠的腎，肝和胃，固定在4%多聚甲醛中并用石蠟包埋，用于免疫組化病理學(xué)分析。使用單向方差分析和t檢驗(yàn)比較平均值。P<0.05的值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)記時間和前體用量對標(biāo)記率的影響

使用不同比例的標(biāo)記前體和反應(yīng)時間標(biāo)記的結(jié)果列于表1，結(jié)果表明，在比例為200 μCi/2 nmol時，標(biāo)記率趨于飽和,可達(dá)(95.4±2.1)%，進(jìn)一步增加前體用量標(biāo)記率沒有明顯提升。標(biāo)記時間10 min時標(biāo)記率趨于飽和，延長標(biāo)記時間不能提高標(biāo)記率，反而會產(chǎn)生不必要的核素衰變損失。

表1 不同標(biāo)記前體用量和標(biāo)記時間對標(biāo)記率的影響Table 1 Effects of different conditions on the labelled rate

因?yàn)榈夂晚镣瑸辂u族元素，化學(xué)性質(zhì)具有相似之處，都可以形成碳鹵鍵。基于優(yōu)化后的131I標(biāo)記尼妥珠單抗條件，進(jìn)行211At對尼妥珠單抗的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記率約95%。

3.2 131I/211At-ATE-nimotuzumab的體外穩(wěn)定性

將純化后的211At-ATE-nimotuzumab、131I-ATE-nimotuzumab分別置于PBS和FBS中，經(jīng)過不同時間后對比其穩(wěn)定性，結(jié)果如圖1所示。211At-ATE-nimotuzumab在PBS中6 h內(nèi)可以保持較好的穩(wěn)定性，6 h后放化純度明顯降低，24 h在PBS中放化純度為(81.5±2.7)%。211At-ATE-nimotuzumab在FBS中仍然能保持一定穩(wěn)定性，但是在PBS中較差。相較而言131I-ATE-nimotuzumab的放化純度在PBS中24 h大于90%，而在FBS中也大于80%。由此可知，在FBS中，211At-ATE-nimotuzumab和131I-ATE-nimotuzumab穩(wěn)定性皆低于PBS中。因?yàn)?11At為α核素，其衰變釋放出α粒子，其反沖能可導(dǎo)致碳-砹鍵斷裂，使核素逃逸，從而導(dǎo)致211At-ATE-nimotuzumab穩(wěn)定性在FBS和PBS中均低于碘標(biāo)記物。

圖1 131I/211At-ATE-nimotuzumab在不同介質(zhì)中放化純度隨時間的變化Fig.1 Changes in radiochemical purity of 131I/211At-ATE-nimotuzumab

3.3 荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布

瘤內(nèi)注射131I-ATE-nimotuzumab后荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布情況如圖2所示，131I-ATE-nimotuzumab在荷瘤鼠體內(nèi)主要保留在腫瘤部位，放射性攝取率為(32.4±3.9)%ID·g-1(3 h)和(28.2±4.7)%ID·g-1(24 h)，在24 h內(nèi)仍然能夠保持相當(dāng)高的放射性攝取，進(jìn)一步說明該藥物確實(shí)具有特異性靶向U87MG腫瘤的能力。同時，體內(nèi)分布也表明，該標(biāo)記物主要通過肝臟、腎臟進(jìn)行代謝，肝臟放射性攝取率為(6.9±2.3)%ID·g-1(3 h)，腎臟放射性攝取率為(1.9±1.1)%ID·g-1(3 h)。值得注意的是，131I-ATE-nimotuzumab在荷瘤鼠體內(nèi)3 h時，甲狀腺和胃的攝取不可忽略，其放射性攝取率分別為(3.2±0.8)%ID·g-1和(2.5±1.3)%ID·g-1，因?yàn)榧谞钕俸臀甘怯坞x的碘容易聚集的器官，這也表明該標(biāo)記化合物在動物體內(nèi)存在一定的核素脫靶現(xiàn)象。相較而言，其他器官和組織的攝取較低，基本無明顯變化。

圖2 瘤內(nèi)注射131I-ATE-nimotuzumab的荷U87MG膠質(zhì)瘤裸鼠的體內(nèi)分布(n=4)Fig.2 In vivo distribution of U87MG glioma-bearing nude mice injected with 131I-ATE-nimotuzumab intratumorally (n=4)

3.4 131I/211At-ATE-nimotuzumab治療荷瘤裸鼠

使用劑量梯度的100、200 μCi的131I-ATE-nimotuzumab和10、20 μCi的211At-ATE-nimotuzumab對荷瘤裸鼠進(jìn)行治療。從圖3荷瘤小鼠體重變化可知，131I標(biāo)記物處理的荷瘤小鼠在注射后體重略有下降，隨后有所恢復(fù)，短期內(nèi)未出現(xiàn)顯著的體重減輕。隨著存活時間的延長，各組荷瘤小鼠的腫瘤恢復(fù)生長，但是明顯觀察到注射標(biāo)記物組荷瘤小鼠的腫瘤生長得到抑制，同時腫瘤生長呈現(xiàn)劑量依賴性。其中，注射劑量200 μCi131I-ATE-nimotuzumab對應(yīng)的腫瘤生長最為緩慢。相較而言，對照組荷瘤小鼠(包括接受相同體積的生理鹽水和200 μCi Na131I組的荷瘤小鼠)中觀察到腫瘤生長最為快速，沒有抑制效果，約12～14 d處死達(dá)標(biāo)荷瘤小鼠。從存活曲線可見，200 μCi Na131I組中位生存時間為14 d，最高計(jì)量治療組的生存時間為31.6 d。

211At-ATE-nimotuzumab瘤內(nèi)注射治療的各組荷瘤小鼠結(jié)果示于圖4，由圖4可知，各組注射后體重變化不大，隨著腫瘤的增大小鼠體重有所下降。同時可以明顯觀察到注射標(biāo)記物組荷瘤小鼠的腫瘤生長受到標(biāo)記藥物的抑制，呈現(xiàn)劑量依賴性。其中，注射劑量(20 μCi211At-ATE-nimotuzumab)對應(yīng)的腫瘤生長最為緩慢。相較而言，對照組荷瘤小鼠(包括接受相同體積的鹽水和20 μCi211At組的荷瘤小鼠)中觀察到腫瘤生長迅速，中位生存期為15.5 d。但注射了游離砹組荷瘤小鼠的腫瘤生長也受到抑制，其中位生存期延長至21 d，相較而言，注射劑量20 μCi的211At-ATE-nimotuzumab組荷瘤小鼠中位生存時間最長為35 d，長于注射200 μCi131I-ATE-nimotuzumab組荷瘤小鼠的中位生存期。

a——各組荷瘤裸鼠的體重變化曲線；b——各組荷瘤裸鼠的腫瘤體積變化曲線；c——各組荷瘤裸鼠的生存率變化曲線圖3 131I-ATE-nimotuzumab對荷膠質(zhì)瘤裸鼠的治療效果(標(biāo)記藥物治療組與對照組之間存在明顯差異，P<0.005)Fig.3 The therapeutic effect of 131I-ATE-nimotuzumab on glioma-bearing nude mice(There was a significant difference between the labelled drug treatment group and the control group, P<0.005)

為了評估131I/211At-ATE-nimotuzumab對荷瘤小鼠的輻射損傷，在治療觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在24 h內(nèi)對處死的荷瘤小鼠進(jìn)行剖檢，以進(jìn)行肝、腎和胃的組織病理學(xué)分析(圖5)。H&E染色，注射生理鹽水，200 μCi131I-ATE-nimotuzumab，20 μCi211At-ATE-nimotuzumab組荷瘤小鼠。肝臟部位病理結(jié)果顯示：各組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列規(guī)則，肝細(xì)胞質(zhì)較為豐富，肝竇輕度擴(kuò)張(圖5中紅色箭頭)；腎臟部位病理學(xué)分析顯示各組腎髓質(zhì)皮質(zhì)分界清晰，腎小球毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，未見明顯炎癥反應(yīng)。胃部結(jié)構(gòu)完整，固有層中可見排列緊密的大量管狀腺，腺體結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列規(guī)則，各層未見明顯異常。其中肝臟有輕微的肝竇擴(kuò)張并無明顯損傷，且與對照組一致，可能是由小鼠批次或者飼養(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致。病理切片進(jìn)一步說明瘤內(nèi)注射給藥，小鼠的內(nèi)臟器官并無明顯輻射損傷。

a——各組荷瘤裸鼠的體重變化曲線；b——各組荷瘤裸鼠的腫瘤體積變化曲線；c——各組荷瘤裸鼠的生存率變化曲線圖4 211At-ATE-nimotuzumab對荷膠質(zhì)瘤裸鼠的治療效果(標(biāo)記藥物治療組與對照組之間存在明顯差異，P<0.005)Fig.4 The therapeutic effect of 131I-ATE-nimotuzumab on glioma-bearing nude mice(There was a significant difference between the labelled drug treatment group and the control group, P<0.005)

圖5 胃、肝、腎組織病理學(xué)切片F(xiàn)ig.5 Histopathological sections of stomach, liver and kindney

根據(jù)核素性質(zhì)，131I(T1/2=8.02 d，Eγ=364 keV和Eβ=606 keV)，211At(T1/2=7.21 h，Eα=5.9 MeV)，相較而言，211At衰變的射線具有更高的能量和較短的射程(55～80 μm)，其傳能線密度(LET)為80～100 keV/μm，與輻射治療的最佳LET(100 keV/μm)非常接近，能直接打斷DNA鏈，具有更強(qiáng)的輻射生物學(xué)效應(yīng)[23]。同時131I釋放的γ射線過高的能量對其治療造成劑量限制，對其診斷造成過高背景等不利影響。盡管在治療實(shí)驗(yàn)中，131I-ATE-nimotuzumab注射劑量更高且其穩(wěn)定性更強(qiáng)，但是本文通過瘤內(nèi)注射方式，有效的避免了體內(nèi)循環(huán)到腫瘤攝取過程中不必要的核素脫靶，加上其射線能量特點(diǎn)差異等，最終導(dǎo)致治療效果略遜于211At-ATE-nimotuzumab。

值得注意的是，由于211At半衰期短，與單克隆抗體的體內(nèi)代謝周期不匹配，通過瘤內(nèi)空腔內(nèi)注射等方式更能減少體內(nèi)循環(huán)時間，合理利用標(biāo)記在單抗上的短半衰期核素，同時也作為鞏固提高術(shù)后治療效果的補(bǔ)充手段，與其他方式(手術(shù)，放療)等協(xié)同作用。例如，美國杜克大學(xué)Zalutsky Michael等用211At標(biāo)記了ch81C6，在18名腦瘤復(fù)發(fā)患者手術(shù)后的切除空腔里面進(jìn)行了211At-ch81C6給藥治療，特定三種癌癥患者的中位生存期明顯延長[24]。因此本研究通過瘤內(nèi)注射的方式也是進(jìn)一步驗(yàn)證核素211At能夠在放射性靶向研究中得到更多的應(yīng)用，并為相關(guān)藥物的臨床前基礎(chǔ)研究提供了重要參考。但是211At核素的研究發(fā)展仍然存在一定的限制，世界范圍內(nèi)能夠產(chǎn)生28 MeV能量范圍左右α粒子束流的加速器并不足以滿足臨床和研究的需求。現(xiàn)有標(biāo)記方法還存在缺陷與不足，標(biāo)記化合物的標(biāo)記率和穩(wěn)定性限制了其臨床化的進(jìn)程[25]。因此進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)211At的臨床化進(jìn)程還需要進(jìn)行不斷地摸索和探究。

4 結(jié)論

本文進(jìn)行了131I/211At一步法標(biāo)記Nimotuzumab的方法的研究，優(yōu)化了標(biāo)記方法，對比了131I/211At-ATE-nimotuzumab體外穩(wěn)定性，在荷U87MG膠質(zhì)瘤小鼠體內(nèi)驗(yàn)證了131I/211At-ATE-nimotuzumab的治療效果，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)記物對荷瘤小鼠的腫瘤生長均有抑制效果呈劑量依賴性，同時延長了小鼠的生存時間，相比之下，注射劑量更低的211At-ATE-nimotuzumab的治療效果優(yōu)于131I-ATE-nimotuzumab。