miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335在人腦膠質瘤組織中的表達及臨床意義

郭 放 楊 強

腦膠質瘤是老年人神經系統最常見的原發性腫瘤疾病，浸潤性生長，具有高復發率、高致殘率以及高死亡率等兇險的臨床特點，已經成為我國公共健康問題之一[1]。臨床上人腦膠質瘤的主要治療手段仍為手術切除，但是其預后較差[2]。目前，由于靶基因藥物治療的研究深入發展，尋找新的藥物靶點的基因治療也為膠質瘤的治療手段開辟了新的路徑。研究證實微小RNA(microRNA，miRNA)可廣泛參與肝癌、胃癌、肺癌以及腦膠質瘤等多系統腫瘤疾病的病理過程，已經成為近年來腫瘤疾病研究領域的熱點[3-6]。既往研究顯示，miRNA-34a通過作用Wnt信號通路抑制膠質瘤細胞的生長[7]；miRNA-145可抑制膠質瘤細胞干性基因的表達從而抑制腫瘤發展[8]；miRNA-150則可通過靶向TGF-β抑制腦腫瘤的侵襲轉移[9]。三者均可在分子層面上抑制膠質細胞瘤的發展，且有成熟的分子機制作為基礎，提示三者為潛在的腦膠質瘤臨床診斷標志物，但尚未有詳細報道，故本研究擬采用PCR檢測miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335在不同級別膠質瘤患者和正常患者腦脊液中的表達，同時采用秩相關分析miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335與不同腫瘤級別的相關性，為探索膠質瘤的發病機制及治療靶點提供新的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

選取2014年5月至2018年5月我院神經外科經病理診斷為膠質瘤腦脊液63例，年齡20～75歲，男性34例，女性29例；選取同期非顱內腫瘤患者腦脊液標本為對照組20例，年齡20～75歲，男性11例，女性9例。根據WHO神經系統腫瘤的分類要求將病例組分為：Ⅰ級15例，Ⅱ級17例，Ⅲ級18例，Ⅳ級13例。根據病理類型分為：星形細胞膠質瘤31例，少突膠質細胞瘤17例，室管膜瘤15例。排除標準：排除患有類風濕、其他惡性腫瘤疾病、糖尿病及甲亢等疾病的患者。兩組患者腦脊液樣本采集檢測均告知患者及家屬，并且患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 PCR法檢測腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145和miRNA-335的表達

使用Trizol試劑盒(Invitrogen，Waltham，MA USA)從腦脊液中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒(Takara，Otsu，Japan)進行逆轉錄以將mRNA轉化為cDNA。用SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes(ThermoFisher，Waltham，MA USA)進行實時PCR。將miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的表達量標準化到GAPDH以獲得相對表達量。使用miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen)對miRNA210進行實時PCR，并將表達量標注化到U6以獲得相對表達量。相關引物如表1。

表1 引物序列

1.3 統計分析

研究結果分別采用2組獨立樣本t檢驗以及spearman相關性統計方法進行分析，P<0.05表示差異有統計學意義，研究數據應用SPSS 19.0軟件進行分析。

2 結果

2.1 兩組患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335水平的比較

采用PCR檢測不同腫瘤級別的患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平，結果提示與對照組相比，病例組腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平顯著降低(t=14.605，P<0.001；t=16.447，P<0.001；t=9.822，P<0.001)，差異均有統計學意義，見表2。

表2 兩組患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335含量比較

2.2 不同級別膠質瘤患者的腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平的比較

根據WHO神經系統腫瘤的分類要求將病例組分為Ⅰ～Ⅳ級膠質瘤患者，其中Ⅰ～Ⅱ級為低級別膠質瘤患者，Ⅲ～Ⅳ為高級別膠質瘤患者。采用PCR檢測患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平，結果提示與低級別膠質瘤組相比，高級別膠質瘤患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平顯著降低(t=5.569，P<0.001；t=4.000，P<0.001；t=6.875，P<0.001)，差異均有統計學意義，具體見表3。

表3 不同級別膠質瘤患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335含量比較

2.3 腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335與膠質瘤分級的相關性

將腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的表達與不同膠質瘤腫瘤級別進行Spearman相關分析，結果顯示，腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335均與膠質瘤患者的腫瘤級別呈顯著負相關(γs=-0.539，P<0.001；γs=-0.571，P<0.001；γs=-0.603，P<0.001)。

3 討論

據統計，惡性膠質瘤約占原發性惡性腦腫瘤的70%，年發病率約為5/10萬，惡性腦膠質瘤5年生存率不足10%[10]。腦膠質瘤多呈浸潤性生長，手術全切難度大，術后放、化療效果差。因此如何早期診斷、判斷腫瘤分級對于膠質瘤預后有著至關重要的作用。miRNA是一種內源性非編碼的小分子RNA，可與靶mRNA的3'-UTR端配對結合，從而可顯著抑制靶mRNA的翻譯，最終可廣泛參與機體內的生理活動[11]。研究證實，多種miRNAs的表達水平可在腫瘤疾病中發生顯著的改變，可在膠質瘤細胞的生長、增殖、凋亡和侵襲等生理活動中起到重要的作用[12-14],并可調節替莫唑胺化療敏感性[15]。其中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335為研究報道與膠質瘤發生發展密切相關的3種miRNA，研究證實在膠質瘤中，miRNA-34a可通過阻滯細胞周期有G1向S期轉化從而顯著抑制U251膠質瘤細胞的過度增殖[16]，腫瘤細胞內miRNA-34a的表達異常與細胞增殖及凋亡相關。在神經母細胞瘤中，染色體1p的雜合缺失導致miRNA-34a表達減少，進而引起腫瘤異常增殖及侵襲能力減弱,miRNA-34a可以通過AKT和Wnt信號通路抑制腦膠質瘤細胞增殖[17]。涂其武等研究顯示，在膠質瘤細胞中miRNA-34a下調MMP2(中基質金屬蛋白酶2,matrix metalloproteinase 2),進而抑制細胞侵襲和遷移能力[18]。miRNA-145在人體多種腫瘤中低表達，如結直腸癌、肝癌、胃癌和神經母細胞瘤等[19]，上調miRNA-145可顯著抑制膠質瘤細胞的發生發展[20]，韓鋮琛等[21]研究表明，膠質瘤組織miRNA-145呈低表達，上調miRNA-145表達能夠抑制膠質瘤細胞系U251細胞增殖能力并誘導U251細胞凋亡。這提示miRNA-145有可能成為膠質瘤治療的靶點。miRNA-335同樣在抑制膠質瘤細胞的侵襲轉移中發揮作用[9]，提示三者為人膠質瘤患者的潛在診斷標志物，但尚未由詳細的臨床診斷研究報道。既往多數研究集中于血漿miRNA檢測，但血漿中所含蛋白種類和濃度相對較高，雖然腦脊液標本來源不易，但正是由于標本的特殊性，腦脊液中所含蛋白的模式比血液簡單得多，miRNA檢測的干擾因素相對較少，能更好篩選標志物，便于重復和統一。袁平等[22]采用熒光定量PCR檢測20例神經膠質瘤患者和20例非膠質瘤患者的腦脊液候選標志物水平，發現miRNA-21在神經膠質瘤中表達顯著高于健康人群，而miRNA-128在神經膠質瘤中表達顯著低于健康對照組，miRNA-21和miRNA-128聯合診斷神經膠質瘤的靈敏度和特異度均為100%，認為腦脊液中miRNA-21和miRNA-128可能是神經膠質瘤潛在的早期診斷標志物。而張青等研究顯示膠質瘤患者腦脊液miRNA-221、miRNA-222表達明顯高于健康人群，高級別膠質瘤患者其表達水平同樣也高于低級別膠質瘤患者，且兩者聯合診斷腦膠質瘤的特異度和敏感度均較高[23]。陳欣等也得出類似結論[24]。

本研究采用PCR技術檢測兩組患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335，并且通過相關統計分析進一步驗證miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335在膠質瘤患者中的表達與腫瘤級別相關性，以期為膠質瘤患者的診斷及藥物靶點治療提供新的方向。研究顯示3種miRNA分子的研究基礎主要集中在腫瘤細胞或組織標本中，但既往研究提示miRNA的表達水平在疾病患者腦脊液和腦組織標本中的表達趨勢基本一致，如阿爾茲海默癥[25]，再者考慮此次研究的初衷是探討三者作為人腦膠質患者的診斷標志物的可能性，二腦脊液的診斷在臨床中較為成熟，故在本次研究中，筆者收集的標本為腦膠質瘤患者、良性腫瘤的腦脊液以及健康對照組的腦脊液。我們研究發現，在膠質瘤患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的表達水平顯著低于正常患者，其在腦脊液中的表達水平可能可以作為診斷膠質瘤的輔助手段。且不同級別膠質瘤患者腦脊液miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-335存在差異，且膠質瘤級別越高，miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-335表達水平越低，提示三者在腫瘤發生發展的抑制作用以及作為臨床人腦膠質瘤患者的潛在診斷標志物可能性，并有助于術中進一步判斷切除范圍及術后放化療的輔助指導。其中miRNA-145的變化與先前研究在膠質瘤細胞中的表達變化是一致的[21]，既往研究已提示miRNA-335作為診斷急性腦卒血患者的潛在血清標志物[26]，而我們的研究為miRNA-335提供了一個新的靶點身份，擴充了miRNA-335的診斷功能；同時我們通過秩相關分析檢測腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的表達，發現其分別與膠質瘤級別呈負相關。這些結果也進一步說明下調的miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA335可參與膠質瘤的發生及浸潤過程，并且可能與膠質瘤的病理級別有關，同時也為膠質瘤的診療標記物提供了新的思路。

然而，本次的研究仍有一定的局限性，由于樣本來源不易，導致樣本數偏少，樣本例數有待進一步擴充，尤其是顱內良性腫瘤；此外由于獲取患者腦脊液樣本的風險較大，臨床志愿者人數較少，尚未能進行統計學意義的隨訪比較，有待在后續工作進行討論；下一步我們將納入其他miRNA檢測研究，綜合分析，全面了解腦膠質瘤患者組織及腦脊液miRNA的差異；進一步分析miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-335與腦膠質瘤具體的作用機制；選取相同疾病的不同來源(腦膠質瘤病理組織、血液)檢測miRNA表達水平，并與腦脊液miRNA表達水平進行比較，進行相關性分析，橫向對比，為腦脊液miRNA判斷術前膠質瘤病理分級提供確切依據。綜上所述，miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335水平在膠質瘤患者腦脊液中顯著下降，且膠質瘤級別越高，miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-335表達水平越低，可能可以作為診斷腦膠質瘤及術前判斷病理分級的輔助方法。