ICP22BP通過調控Wnt信號通路影響膠質母細胞瘤細胞增殖的研究

黨 利 王長爽 王 帥

膠質母細胞瘤也稱為多形性膠質母細胞瘤 (GBM)，是最致命和最常見的腦腫瘤形式之一，多發于40～60歲年齡段的人群[1,2]。大約 80% 的 GBM 腫瘤位于大腦半球，只有不到 5%的GBM腫瘤位于小腦、腦干和脊髓[3]。雖然目前臨床上對于GBM的治療研究已經有了大量的進展，但是其五年存活率依然令人沮喪。這其中一個重要原因是GBM的高復發性和較強的藥物耐受[4,5]。造成GBM的高復發和藥物耐受的主要原因是GBM通常以膠質母細胞瘤干細胞(GSCs)的存在為特征[6]。而目前已經有很多研究表明GSCs與GBM的復發與耐藥有關，此外由于其存在于血管周圍而難以靶向造成腫瘤細胞的持續更新[6-8]。

GSCs細胞通過多種信號通路維持其干細胞狀態[7,9]，這其中越發引起研究者注意的一條信號通路就是Wnt信號通路。目前已有研究報道Wnt信號通路的失調與神經元來源的體細胞惡性腫瘤相關[10]。Wnt信號通路作為細胞間交流、細胞命運決定和細胞遷移的重要調節因子。Wnt信號失調通常與其重要的組成原件突變有關，而Wnt信號的失調常常與癌癥相關。異常的Wnt信號在多種癌癥均有發現，通常表現為Wnt信號的異常激活從而造成其下游基因的大量轉錄。

本研究基于臨床病例的表達量檢測和TCGA數據庫分析揭示出ICP22BP在GBM癌組織中的表達量顯著高于在GBM癌旁組織中的表達量。此外我們還證明 ICP22BP通過影響Wnt信號通路從而促進GBM細胞系A172細胞增殖。這為后續GBM的治療研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 GBM病例收集

本研究于2018年1月至2020年12月在河南大學附屬醫院采集了86例GBM患者的臨床樣本。該GBM患者隊列的人口統計數據如表1所示。本試驗獲得河南大學倫理委員會批準，所有患者均獲得書面知情同意。

表1 GBM患者樣本特征

1.2 細胞培養和轉染

將A172細胞維持在含有10%FBS(GETMHyclone，Utah,U.S)、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素(SH30010，GETMHyclone，Utah,U.S)的完全DMEM培養基中，并在細胞培養箱中培養(37℃和 5%CO2)。

A172細胞在轉染前一天進行傳代培養，以達到30%～50%的匯合度。使用終濃度為50 nM Lipofect-amine 2000轉染試劑進行細胞轉染，轉染混合液孵育4 h后，使用完全培養基換液，48 h后檢測基因表達情況和細胞增殖。

1.3 實時熒光定量PCR

采用Trizol(15596018,Life Technologies,USA)法提取全細胞RNA，然后使用BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒(Beyotime Biotechnology,Shanghai,China)將RNA轉錄成cDNA。BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)(D7260,Beyotime Biotechnology,Shanghai,China)試劑盒用于進行實時PCR檢測。qPCR實驗結果采用2-△△CT法計算。引物序列見表2。

表2 不同基因的引物序列

1.4 蛋白質印跡分析

應用BeyoLyticTM哺乳動物活性蛋白提取試劑(Beyotime Biotechnology，上海，中國)提取細胞和組織總蛋白。然后用30～40 μg細胞總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白轉膜。然后將轉移的NC膜與相應的一抗：anti-ICP22BP(ab247013，abcam，USA)和anti-GAPDH(ab8245，abcam，USA)(1∶500)在 4℃下孵育過夜。

1.5 細胞增殖試驗

將消化后各組細胞鋪96孔板，每孔1×104個細胞。各時間點(0 h、24 h、48 h、72 h)收集細胞，加入10 ml CCK8溶液單液細胞增殖檢測液。孵育4 h后，使用酶標儀檢測OD492的吸光度。

1.6 數據統計分析

所有統計數據均采用T檢驗，數據分析軟件為GraphPad Prism 6，P<0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 ICP22BP基因在GBM腫瘤組織中高表達

通過對于GBM TGCA和GETX數據中ICP22BP的mRNA表達量分析，發現與正常腦部組織相比，GBM腫瘤組織中ICP22BPmRNA表達水平顯著升高(圖1A)。為了進一步確定，收集的86例GBM患者病例樣本中對比癌旁組織中和GBM腫瘤組織中ICP22BP mRNA表達水平。qPCR結果顯示，ICP22BP在GBM患者病例樣本的癌旁組織和GBM腫瘤組織中表達趨勢與數據庫分析結果一致：GBM腫瘤組織中的ICP22BP mRNA表達水平要顯著高于癌旁組織(圖1B)。隨機取3例GBM患者病例樣本的癌旁組織和GBM腫瘤組織進行蛋白質印跡分析實驗，分析ICP22BP蛋白表達水平趨勢。蛋白質印跡分析實驗結果顯示：ICP22BP蛋白表達水平趨勢與mRNA水平表達一致(圖1C)。上述實驗結果表明，ICP22BP基因在GBM腫瘤組織顯著高表達。提示，ICP22BP基因可能是作為促癌基因在GBM中存在。

注：A為對于TCGA數據庫中GBM腫瘤組織樣本和GETX數據樣本中ICP22BP的mRNA 表達水平；B為收取的86例GBM病例樣本中癌旁組織和腫瘤組織中ICP22BP的mRNA 表達水平；C為收取的86例GBM病例樣本中隨機取3例的癌旁組織(P-1,P-2,P-3)和腫瘤組織(T-1,T-2,T-3)中ICP22BP的蛋白表達水平。圖1 ICP22BP的mRNA表達水平

2.2 敲低ICP22BP表達顯著抑制GBM細胞的細胞增殖

ICP22BP在GBM腫瘤組織中呈顯著高表達，推測ICP22BP基因可能是作為促癌基因在GBM中存在。為了驗證這個猜想，在GBM細胞系A172細胞中通過siRNA敲低ICP22BP的表達。如圖2A&B所示，通過siRNA成功敲低了ICP22BP的表達。隨后細胞增殖實驗結果表明ICP22BP的表達減少會顯著抑制A172細胞的細胞增殖(圖2C)。這些實驗數據表明，ICP22BP基因可以促進A172細胞的增殖。這與：“ICP22BP基因可能是作為促癌基因在GBM中存在”一致。

注：A&B為A172細胞中轉染siRNA-NC和siRNA-ICP22BP處理48 h后，ICP22BP的蛋白(A)和mRNA(B)表達水平；C為A172細胞中轉染siRNA-NC和siRNA-ICP22BP處理細胞增殖速率；D為A172細胞中轉染siRNA-NC和siRNA-ICP22BP處理48 h后,wnt信號通路下游相關基因mRNA表達水平。圖2 ICP22BP表達對GBM細胞增殖的影響

2.3 ICP22BP基因與wnt信號通路在A172細胞中的相互作用

之前研究報道，wnt信號通路的失調在GBM發生發展過程中起到重要作用。具體表現特征是wnt信號通路在GBM腫瘤組織中異常激活。由于ICP22BP在GBM腫瘤組織中高表達，猜測ICP22BP可能與wnt信號通路在ICP22BP中出現互作。為了驗證這個猜想，在A172細胞中敲低ICP22BP的表達，觀察ICP22BP基因表達量下降對于wnt信號通路下游相關基因表達的影響。qPCR結果顯示，在A172細胞中敲低ICP22BP的表達可以顯著抑制wnt信號通路下游相關基因(cMYC，c-JUN,WISP1和PPARD)表達。這表明，ICP22BP基因與wnt信號通路在GBM細胞中存在相互作用。

3 討論

膠質母細胞瘤 (GBM)，作為最致命和最常見的腦腫瘤形式之一，目前臨床上有效的治療手段還十分有限。究其原因，主要還是我們對于GBM發病機理和發生發展過程中相關分子機制了解十分有限。基于此我們通過對于TCGA和GETX數據中GBM相關基因表達信息進行分析，以期能夠找到新的線索。我們發現ICP22BP這一基因在GBM腫瘤組織中的異常高表達，提示我們這一基因可能在GBM中行駛促癌基因功能。同時我們在對于GBM患者相關臨床樣本驗證中也證明了，ICP22BP這一基因在GBM腫瘤組織中的異常高表達。同時在敲低ICP22BP基因時發現會顯著抑制GBM細胞系A172細胞的細胞增殖。這些數據表明，ICP22BP這一基因可能在GBM中行駛促癌基因功能。

wnt信號通路分為經典wnt信號通路和非經典wnt信號通路，其中經典wnt信號通路轉錄的相關下游基因：cMYC，c-JUN,WISP1和PPARD等，常常與癌癥發生發展相關[11-14]。這與我們的發現一致：下調ICP22BP基因的表達可以顯著抑制經典wnt信號通路下游基因的轉錄。這也從側面驗證ICP22BP基因是通過調節經典wnt信號通路從而影響GBM細胞A172細胞的細胞增殖。這其中相關具體的調節機制，本研究中并沒有研究。這也是我們后續的研究重點：找出ICP22BP基因調節經典wnt信號通路潛在分子機制。

綜上所述，本研究證明了ICP22BP基因在GBM腫瘤組織中高表達。同時ICP22BP基因通過調節經典wnt信號通路從而影響GBM細胞A172細胞的細胞增殖。這為GBM的后續病理機制相關研究提供了一定的理論基礎。