甲氨蝶呤(MTX)與匹莫齊特(Pimozide)聯(lián)合使用對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑制效果

牟大超 吳沙沙 周 軼 白秀峰

目前，腫瘤的治療手段包括傳統(tǒng)手術(shù)治療、放化療、小分子抑制劑治療、單克隆抗體治療以及細(xì)胞靶向治療等[1-4]。傳統(tǒng)的手術(shù)治療不能保證病灶的完全切除，易復(fù)發(fā)[5,6]；放化療會(huì)波及正常細(xì)胞，產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用[7,8]；生物靶向治療存在耐藥性，且較難尋找腫瘤特異性抗原和治療靶點(diǎn)等[9,10]；單一小分子藥物使用時(shí)濃度高，易產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用，同時(shí)容易產(chǎn)生耐藥性。隨著研究深入，制備多種小分子的聯(lián)合藥物，有望使各藥物分子發(fā)揮協(xié)同增加的作用，降低單一藥物使用劑量，降低毒副作用和耐藥性[11,12]。甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)是一種抗葉酸類抗腫瘤藥，通過(guò)抑制二氫葉酸還原酶，使二氫葉酸不能還原成四氫葉酸，從而導(dǎo)致DNA的合成受到抑制而阻礙腫瘤細(xì)胞的合成，達(dá)到抗腫瘤目的，但單一長(zhǎng)期使用可引起胃腸道反應(yīng)、肝損傷和腎損傷等[13,14]。匹莫齊特(Pimozide)，近期報(bào)道顯示，其可通過(guò)抑制stat3和stat5磷酸化水平，達(dá)到抗腫瘤目的，但單一使用效果不佳[15-16]。本文將MTX和Pimozide聯(lián)合使用，探討不同濃度配比對(duì)人胃癌細(xì)胞系MKN45和MKN74的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞系MKN45和MKN74由華西醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng)，本科室凍存。

1.1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640培養(yǎng)基和青霉素鏈霉素購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自阿根廷Natocor公司，CCK8檢測(cè)試劑購(gòu)自索萊寶公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與孔板設(shè)置 體外培養(yǎng)MKN45和MKN74細(xì)胞系，培養(yǎng)基為RPMI 1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%新生牛血清)，細(xì)胞置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后，使用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞消化完成后，加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基終止消化。300 g×5 min離心后，收集細(xì)胞。使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，制成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，以每孔12000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100 μl。設(shè)置空白對(duì)照孔：僅含100 μl完全培養(yǎng)基；細(xì)胞對(duì)照孔：僅含細(xì)胞和完全培養(yǎng)基，不加藥物處理；藥物處理孔：含細(xì)胞和不同濃度藥物(藥物為單獨(dú)使用MTX、單獨(dú)使用Pimozide以及MTX和Pimozide聯(lián)合使用，藥物用DMSO溶解，配制成10 mmol/L母液，使用時(shí)用培養(yǎng)基配制成相應(yīng)濃度)。將96孔板置于二氧化碳孵箱中培養(yǎng)24 h。棄孔板中原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基配制的不同濃度藥物溶液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.2 細(xì)胞存活率檢測(cè) 使用CCK8檢測(cè)試劑盒，操作按說(shuō)明書(shū)所示。在96孔板各孔中加入CCK8溶液10 μl，37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。使用酶標(biāo)儀，在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度OD值，記錄結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞存活率。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞存活率計(jì)算公式：細(xì)胞存活率=(A藥物處理孔-A空白對(duì)照孔)/(A細(xì)胞對(duì)照孔-A空白對(duì)照孔)。

1.2.3 藥物聯(lián)合使用協(xié)同指數(shù)計(jì)算 為了進(jìn)一步分析MTX和Pimozide的協(xié)同作用效果，使用本領(lǐng)域認(rèn)可且廣泛使用的CompuSyn軟件，對(duì)各濃度下MTX和Pimozide的協(xié)同指數(shù)進(jìn)行了計(jì)算分析，協(xié)同指數(shù)CI<1.1表示有協(xié)同增效作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)。細(xì)胞存活率分析采用單因素重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，P<0.05判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 單獨(dú)/聯(lián)合使用Pimozide(匹莫齊特)和MTX(甲氨蝶呤)對(duì)MKN45的抑制效果

單獨(dú)使用Pimozide時(shí)，Pimozide劑量(0～1 μM)太小對(duì)MKN45細(xì)胞幾乎沒(méi)有抑制效果，只有Pimozide大劑量(2～4 μM)使用才對(duì)MKN45細(xì)胞有抑制效果(存活率<70%)，且隨著Pimozide濃度增加，抑制效果增加。單獨(dú)使用MTX時(shí)，對(duì)MKN45細(xì)胞的抑制效果均很差(各濃度下存活率均>70%)(表1、圖1)。

圖1 單獨(dú)使用Pimozide或MTX抑制MKN45細(xì)胞的細(xì)胞存活率

Pimozide和MTX聯(lián)合使用后，可以在減小藥物使用劑量的情況下，顯著提高對(duì)MKN45細(xì)胞的抑制效果，降低毒副作用。其中，當(dāng)Pimozide濃度為4 μM，MTX濃度為0.1～20 μM時(shí)，細(xì)胞活性受到十分顯著抑制，細(xì)胞存活率低于15%(表1、圖2)。

圖2 聯(lián)合使用Pimozide和MTX抑制MKN45細(xì)胞的細(xì)胞存活率

表1 不同濃度MTX或/和Pimozide作用于MKN45細(xì)胞72h的細(xì)胞存活率

使用CompuSyn軟件分析，當(dāng)MTX濃度>0.1 μM時(shí)，各濃度Pimozide和MTX聯(lián)合使用對(duì)MKN45的抑制效果具有協(xié)同增效作用(表2)。

表2 MTX和Pimozide聯(lián)合藥物作用于MKN45細(xì)胞72h的聯(lián)合藥物協(xié)同指數(shù)值(CI)

2.2 單獨(dú)/聯(lián)合使用Pimozide(匹莫齊特)和MTX(甲氨蝶呤)對(duì)MKN74的抑制效果

單獨(dú)使用Pimozide時(shí)，Pimozide劑量(1 μM)太小對(duì)MKN74細(xì)胞幾乎沒(méi)有抑制效果，只有Pimozide大劑量(2～4 μM)使用才對(duì)MKN74細(xì)胞有抑制效果(存活率<70%)，隨著Pimozide濃度增加，抑制效果增加。單獨(dú)使用MTX時(shí)，對(duì)MKN74細(xì)胞的抑制效果均很差(表3、圖3)。

圖3 單獨(dú)使用Pimozide或MTX抑制MKN74細(xì)胞的細(xì)胞存活率

Pimozide和MTX聯(lián)合使用后，可以在減小藥物使用劑量的情況下，顯著提高對(duì)MKN74細(xì)胞有抑制效果。即Pimozide和MTX聯(lián)合使用后既可以提高對(duì)胃癌細(xì)胞MKN74的抑制效果，又可以降低藥物使用劑量，降低毒副作用。其中，當(dāng)Pimozide濃度為4 μM，MTX濃度為0.01～20 μM時(shí)，細(xì)胞活性受到十分顯著抑制，細(xì)胞存活率低于15%(表3、圖4)。

圖4 聯(lián)合使用Pimozide和MTX抑制MKN74細(xì)胞的細(xì)胞存活率

表3 不同濃度MTX或/和Pimozide作用于MKN74細(xì)胞72 h的細(xì)胞存活率

使用CompuSyn軟件分析，當(dāng)Pimozide濃度>1 μM時(shí)，各濃度MTX和Pimozide聯(lián)合使用對(duì)MKN74的抑制效果具有協(xié)同增效作用(表4)。

表4 使用CompuSyn軟件計(jì)算MTX和Pimozide聯(lián)合藥物作用于MKN74細(xì)胞72h的聯(lián)合藥物協(xié)同指數(shù)值(CI)

3 討論

甲氨蝶呤在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用已有很長(zhǎng)的歷史，對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，但大劑量使用會(huì)引起骨髓抑制和肝功能異常等不良反應(yīng)[17-18]。匹莫齊特的抗腫瘤活性，最早由R Taub和M Baker報(bào)道[19]，用于黑色素瘤的治療。近年來(lái)，越來(lái)越多的報(bào)道顯示，匹莫齊特具有抗多種腫瘤活性[20-21]。但是，使用單一藥物治療腫瘤，需要的藥物濃度較大，會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的副作用。

將甲氨蝶呤和匹莫齊特聯(lián)合使用，對(duì)腫瘤細(xì)胞，特別是胃癌細(xì)胞MKN45以及高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞MKN74的抑制效果顯著優(yōu)于單獨(dú)使用甲氨蝶呤和匹莫齊特，并發(fā)揮了協(xié)同增效抗腫瘤以及防止腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。此外，將甲氨蝶呤和匹莫齊特聯(lián)合使用，可以減少藥物的使用劑量，降低藥物毒副作用，安全性更好。將甲氨蝶呤和匹莫齊特作為活性成分制備抗腫瘤藥物，或者將甲氨蝶呤和匹莫齊特用于制備抗腫瘤聯(lián)合用藥物，具有良好的應(yīng)用前景。