高效液相色譜-甲烷動態反應電感耦合等離子體質譜法測定谷物中痕量硒形態

周 婭，李 霞， 羅麗卉， 王 棚

(四川省農業科學院分析測試中心；農業農村部食品質量監督檢驗測試中心(成都),成都 610066)

硒是人體必需的微量元素，它是抗氧化防御系統和甲狀腺激素代謝過程的重要組成部分，并具有許多生理功能，例如免疫調節特性和對重金屬的拮抗作用[1-3]。人體不能自身合成硒，食物鏈是人體中硒的主要來源。植物和動物中的硒濃度基本上是由地質決定的，但是硒在土壤中的分布極其不均勻，中國大約51%的土壤中缺乏硒[4]，在中國中度硒缺乏地區，每天主要的硒攝入來源是肉類和谷物，分別占67.8%和22.6%[5]，通過生物強化生產富含硒的作物是增加缺硒地區居民硒攝入的一種安全有效的方法[6]。

硒的代謝途徑、生物利用度、生理功能和毒性取決于攝入量和化學形式(物種)[7]。通常，硒的有機形式如硒代蛋氨酸(SeMet)，硒代半胱氨酸(SeCys)和甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)比無機硒具有更高的生物利用度和較低的毒性[8]。現行食品安全國家標準方法無法對硒的存在形態進行定性和定量分析，因此硒形態分析對谷物營養價值評價及安全風險評估具有至關重要的意義。

目前國內外在硒形態研究方面已有一些報道，其中HPLC-ICP-MS和HPLC-AFS聯用技術是目前分析硒形態應用最多的兩種方法。其中原子熒光檢測需要紫外光輻照，其形態轉化效率有待提高[9]；ICP-MS檢測對硒豐度較大的同位素存在明顯的多原子離子干擾(80Se豐度49.6%，但80Se易受到等離子氣40Ar40Ar+的同量異位素干擾，無法進行測定)，現有文獻基本均采用氦氣碰撞降低部分干擾，只檢測同位素78Se(豐度23.77%)或82Se(豐度8.73%)，但靈敏度較低，檢出限較高，因此低硒樣品中硒形態由于含量低而無法進行檢測，進而限制了檢測樣品類型的范圍[10-12]。本實驗利用甲烷氣體消除質譜干擾，測定豐度最大的同位素80Se，大幅度提高方法靈敏度，降低其檢出限，同時對前處理提取方法以及流動相種類等條件優化，建立了谷物中5種硒形態的測定方法，以期為谷物類食品中不同硒物種的測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒黑米、糙米、小米：市售。

硒單元素標準溶液(GBW(E)082114, 100 mg/L); 硒酸根Se(Ⅵ)(GBW10033, 75.1 μg/L)，亞硒酸根Se(Ⅳ)(GBW10032, 68.9 μg/L)、 硒代蛋氨酸SeMet (GBW10034,97.9 μg/L)、硒代胱氨酸SeCys (GBW10087, 93.5 μg/L)、甲基硒代半胱氨酸SeMecys (GBW10088, 96.6 μg/L);蛋白酶XIV; 檸檬酸、氨水、硝酸等其他化學試劑均為優級純；色譜進樣前所有樣品都經0.22μm濾膜過濾。

1.2 儀器與設備

A-10型液相色譜儀，NexioN300D型電感耦合等離子體質譜儀，TOPEX+微波消解儀，PRP-X100 陰離子交換柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 總硒前處理

參照 GB 5009.268—2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》, 稱取0.5 g樣品置于消解內罐中, 加入8 mL 濃硝酸，放入微波消解儀消解，消解完畢后，再以180 ℃趕酸至罐內液體剩余1 mL左右，冷卻后用超純水少量多次定容至25 mL后上ICPMS, 同時做空白實驗。

1.3.2 硒形態測定樣品前處理

稱取0.5 g(精確到0.001 g)， 溶解在10 mL Tris-HCl(100 mmol/L， pH7.4)中，加入蛋白酶XIV100 mg，在37 ℃下振蕩酶解12 h。酶解后，以8 000 r/min離心10 min，取上清液 ，過0.22 μm濾膜后供HPLC-ICP-MS測定，同時做樣品空白 。

1.4 儀器條件

液相色譜條件: PRP-X100 陰離子交換柱(250 mm×4.6 mm，5 μm); 流動相 為 5 mmol/L 檸檬酸(pH5.0)，流速為1.0 mL/min,進樣量為100 μL。

ICP-MS 檢測條件: RF 發射功率 1 500 W；輔助氣流量1.2 L/min；等離子氣流量18 L/min；霧化器流量0.89 L/min；采樣錐：鎳錐；霧化器：同心玻璃霧化器。

2 結果與分析

2.1 甲烷流量和反應池抑制參數Rpq值優化

Se在自然界中有74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se 6個同位素。74Se、76Se、77Se和82Se的豐度值較低，其信號值響應低；78Se和80Se的自然豐度大，信號較強，但等離子氣體氬氣電離時產生的38Ar40Ar+、40Ca38Ar+、41K37Cl+、39K39K+、40Ar40Ar+都會產生同量異位干擾，使檢測硒的能力大大降低，導致檢出限變差，甚至無法直接測定。本實驗采用動態反應池(DRC)技術來降低此類干擾，以期為硒檢測提供更高的靈敏度和更低的檢測限。

動態反應池技術一般采用氧氣、氨氣、甲烷或者混合氣作為反應介質降低或消除某些元素的質譜干擾。甲烷與80Se的主要干擾物40Ar40Ar+之間發生放熱反應，并且具有較高的速率常數，故本研究采用甲烷作為反應氣[13]。動態反應池技術主要由2個參數控制：反應氣體流速和反應池抑制參數(Rejection Parameter q，Rpq)，后者用作低質量截止值，可以使得一定質量數以下的離子被剔除，降低背景噪聲。本研究中反應氣甲烷流量和反應池抑制參數Rpq值對80Se信號強度的影響見圖1(基質空白為5 mmol/L檸檬酸，Se標準溶液質量濃度為1 μg/L)。隨著甲烷流量從0.2 mL/min逐漸增加至1.0 mL/min，基體背景信號逐漸降低最后趨于穩定，當甲烷流量為0.6 mL/min時80Se信號噪聲比最大；Rpq為0.5時，80Se信噪比最大。實驗選擇甲烷流量為0.6 mL/min，反應池抑制參數Rpq為0.5。

圖1 甲烷流量和反應池抑制參數Rpq對基體空白和Se信號強度的影響

2.2 流動相類型的優化

陰離子交換色譜分離硒化合物常用流動相包含緩沖鹽溶液(乙酸鹽，檸檬酸或磷酸鹽)和小部分(2%～5%)的有機改性劑(例如甲醇)[14-16]。本實驗考察了磷酸氫二銨、乙酸銨、檸檬酸作為流動相對5種硒形態的分離情況的影響。結果表明：10 mmol/L乙酸銨(pH 5.2)作為流動相時，甲基硒代胱氨酸和亞硒酸根的峰形會發生重疊現象，不能有效分離；40 mmol/L磷酸氫二銨(pH 6.0)作為流動相時基本能分離5中硒形態，但硒代蛋氨酸靈敏度低，硒酸根出峰時間為26 min，分離耗時較長，信號強度較弱；5 mmol/L檸檬酸(pH 5.0)作為流動相時，有機硒和無機硒分離效果較好(見圖2)，這與姚真真等[12]的研究結果一致。本研究選擇5 mmol/L檸檬酸(pH 5.0)作為流動相，5種硒形態在20 min內達到基線分離，且峰形與信號較好。

注：a流動相為10 mmol/L乙酸銨(pH5.2)；b流動相為40 mmol/L磷酸氫二銨(pH6.0)；c流動相為5 mmol/L檸檬酸(pH5.0)。圖2 流動相種類對硒形態分離的影響

2.3 樣品中硒形態提取條件的優化

食品中硒形態的提取主要方式為液相萃取、液相微萃取和固相微萃取等[17,18]。提取過程中不同形態的硒很容易受到提取介質的影響發生轉變或損失，因此從食品基質中提取硒不同形態的技術關鍵在于能否顯著提高樣品提取效率。本研究對比了液相萃取中蛋白酶用量和提取時間對硒形態提取效率的影響。

本研究考察了富硒黑米中加入蛋白酶XIV20、40、60、80、100 mg時樣品的提取效率，結果見表1。研究結果表明：黑米樣品中5種硒形態主要檢出硒代胱氨酸(SeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet)，蛋白酶XIV的加入量直接影響SeMet的提取量；加入蛋白酶XIV20 mg時，樣品的提取效率僅為39.0%，酶加入量增加后，提取效率顯著提高。加入100 mg時，提取效率能達到90%，所以本實驗選擇加入100 mg蛋白酶XIV。

表1 蛋白酶XIV用量對硒形態提取效率的影響

本研究優化了不同提取時間對提取效率的影響。分別研究了37 ℃振蕩提取時間 8、 12、 24、48 h對硒形態提取效率的影響。實驗結果表明：當提取時間為8 h時，提取效率只有70%；當提取時間逐漸延長，提取效率升高；當提取時間為12 h和24 h時，提取效率變化不大，均達到了90%；提取時間為48 h時，有很大的雜峰，懷疑提取時間過長硒形態發生了轉變。本研究提取時間選擇為12 h。

2.4 線性關系及檢出限

使用本實驗優化的條件進行檢測，硒代胱氨酸(SeCys)、甲基硒代半胱氨酸(SeMecys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒酸根Se(Ⅵ), 亞硒酸根Se(Ⅳ)的線性范圍為0.50～50 μg/L，線性相關系數(R2)均大于0.999 9，以3倍信噪比計算檢出限，硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根的檢出限分別為0.01、0.05、0.05、0.20、0.10 μg/L，比相關研究的檢出限均低[10-12,19,20]。5種硒形態的線性范圍、線性方程、相關系數和檢出限見表2。

表2 5種硒形態的線性范圍、線性方程、相關系數和檢出限

2.5 方法回收率與精密度

選取富硒黑米樣品進行加標回收和精密度實驗。按 1.3.2 方法處理樣品，黑米中5種硒形態僅檢出了硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，其余形態均未檢出。對黑米樣品進行低、中、高3 個濃度水平的加標回收實驗, 每個水平平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。 結果表明, 5 種硒形態的加標回收率88.5%～105.0%，相對標準偏差為1.1%～4.4%, 說明本方法具有良好的準確度和精密度(見表3)。

2.6 實際樣品分析

使用HPLC-DRC-ICP-MS方法分析了市售糙米、黑米、小米中5種硒形態，結果見表4。結果發現，谷物中的硒含量差異較大，糙米和黑米中的硒成分以硒代蛋氨酸(SeMet)為主，含有少量硒代半胱氨酸SeCys，小米中硒的成分全部以硒代蛋氨酸(SeMet)的有機形態存在。使用本方法的提取程序，谷物樣品中有機硒含量占總硒含量的87.5%～91.5%，這說明富硒谷物中含有豐富的有機硒成分，可作為良好的補硒產品。

表3 黑米中5種硒形態的加標回收率和精密度(n=6)

表4 市售谷物中的5種硒形態測定結果

3 結論

利用恒溫振蕩輔助酶萃取進行樣品前處理，建立了HPLC-DRC-ICPMS聯用技術測定谷物中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根5種常見硒形態的分析方法。該方法操作簡單、靈敏度高、精密度和準確度良好，為各類谷物樣品中的硒形態分析提供了一種簡單而靈敏的測定技術。