小米中4種蛋白的分級提取及結構表征

侯超凡， 陳振家， 郝利平

(山西農業大學食品科學與工程學院，太谷 030801)

小米又稱栗米，是我國北方廣泛種植的作物之一，由谷子脫殼而成[1]。小米所含的各種營養素豐富，口感良好，深受北方人的喜愛[2]。小米中營養素比例比較均衡，是一種良好的飲食來源。相較于其他常見的谷物，小米的營養價值更優，與水稻、玉米等谷物相比，小米的蛋白質含量更高[3]；與大米和小麥等谷物相比，小米中所含的鈣、膳食纖維也更多[4]。同時，小米蛋白也是優質蛋白的來源，其消化率高達83.4%，可用于食品調味品、營養強化劑、食品添加劑等多個領域中[5]。

小米中含有豐富的蛋白質，其蛋白具有低過敏性的特點[6]。小米蛋白質的氨基酸組成模式中賴氨酸和蘇氨酸是限制性氨基酸，但其必需氨基酸的含量高于稻米和小麥[7]。小米蛋白質根據溶解特性分為4種蛋白，水溶性的清蛋白，鹽溶性的球蛋白，醇溶性的醇溶蛋白以及堿溶性的谷蛋白[8]。大多數谷物蛋白有一個共同特點：谷物蛋白中清蛋白和球蛋白的含量極少，醇溶蛋白和谷蛋白含量較高。魏益民等[9]用Osborne分級提取法提取小米蛋白，結果發現醇溶蛋白和谷蛋白分別占46.0%和21.2%，清蛋白和球蛋白共占5.5%。與玉米醇溶蛋白相似，小米醇溶蛋白表面疏水性高，難溶于水，易溶于醇[10，11]。姬中偉[7]對小米醇溶蛋白進行改性酶解制備了具有抗氧化活性的小米醇溶蛋白肽，結果發現酶解小米醇溶蛋白肽在小鼠體內具有抗氧化和抗炎活性。目前小米蛋白的提取方法主要為堿提酸沉法[12]和Osborne分級提取法，楊樺等[13]發現超聲波輔助酶法有助于提取蛋白。然而目前國內外對于小米蛋白完整的結構表征報道較少。

采用Osborne分級提取法提取小米4種蛋白，對4種蛋白的微觀形態，亞基分子質量分布，粒徑和Zeta-電位，二級結構，紫外光譜、熒光光譜以及表面疏水性進行結構方面的研究，為小米蛋白產品的應用和開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

晉谷21號小米購于山西晉中；PBS緩沖液；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒；考馬斯亮藍G250；5x非還原型蛋白上樣緩沖液；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SHIA-10A-50A冷凍干燥機；Nicolet iS10傅里葉紅外(FT-IR)光譜儀；JSM-7500F冷場發射掃描電子顯微鏡；YS-04A小型高速粉碎機；KDC-1044L大容量低速離心機；HC-2064高速離心機。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將小米粉碎、過篩，用石油醚對小米粉進行脫脂，干燥后采用Osborne分級提取法[14]分級提取出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。清蛋白使用蒸餾水(料液比1∶10)進行提取，球蛋白使用質量分數為2%的氯化鈉溶液(料液比1∶10)進行提取，醇溶蛋白使用80%乙醇溶液(料液比1∶10)進行提取，谷蛋白使用0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液(料液比1∶10)進行提取，提取出的蛋白進行透析除鹽。

1.3.2 掃描電鏡觀察

使用冷場掃描電子顯微鏡[15]對小米4種蛋白進行微觀形態觀察，加速電壓為5 kV，觀察倍數為1 000～30 000，使用配套軟件進行捕捉圖像。

1.3.3 SDS-PAGE分析

參考Laemmli[16]的SDS-PAGE法對小米4種蛋白進行分析，將蛋白樣品溶解于還原型上樣緩沖液中，振蕩完全后置于沸水中充分反應5 min，冷卻后離心備用。電泳膠采用12%的分離膠和5%的濃縮膠制得，在電泳槽位依次加入5 μL的Maker蛋白標樣以及20 μL的蛋白上樣緩沖液。濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為150 V，條帶距底部1 cm處電泳停止。將電泳膠進行染色及脫色后掃描成圖分析。

1.3.4 粒徑分布、平均粒徑及Zeta電位測定

通過電位分析儀對小米4種蛋白組分懸浮粒徑進行測定，清蛋白、球蛋白及谷蛋白用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋至1 mg/mL進行測定，醇溶蛋白用70%乙醇溶液稀釋至1 mg/mL進行測定，測定三次結果取平均值，采用相同方法進行Zeta-電位測定[17]。

1.3.5 傅里葉紅外光譜測定

利用傅里葉紅外光譜儀對小米4種蛋白的二級結構進行測定[18]，將凍干樣品和溴化鉀研磨均勻后壓片置于光譜儀中進行分析，記錄樣品在400～4 000 cm-1透過率的變化。

1.3.6 紫外光譜測定

通過紫外分光光度計測量小米4種蛋白溶液的紫外光譜[19]，掃描波長范圍為200～400 nm，掃描速度為300 nm/min，數據間隔為0.5 nm。清蛋白、清蛋白、谷蛋白使用PBS緩沖液(pH 7.4)稀釋到1 mg/mL進行測定，醇溶蛋白用70%乙醇溶液稀釋至1 mg/mL進行測定[20]，每個測定做三組平行結果取平均值。

1.3.7 熒光光譜測定

使用熒光光度計測量小米4種蛋白溶液的熒光光譜[21]，設定激發波長為280 nm，狹縫寬度為3 nm，掃描波長范圍為290～430 nm。清蛋白、清蛋白、谷蛋白使用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋到1 mg/mL進行測定，醇溶蛋白用70%乙醇溶液稀釋至1 mg/mL進行測定，每個測定做三組平行取平均值。

1.3.8 表面疏水性測定

通過ANS熒光探針法[22]測定小米4種蛋白的表面疏水性。使用0.02 mol/L的PBS緩沖液(pH 7.4)將4種蛋白分別稀釋至0.01、0.05、0.1、0.2 mg/mL，將4 mL的蛋白稀釋液與20 μL的ANS溶液(8 mmol/L)混合振蕩后避光反應，15 min后放于熒光光度計中測定熒光強度。將蛋白質量濃度(mg/mL)與測得的熒光強度作圖，經過線性回歸擬合后求得斜率作為4種蛋白的表面疏水性。

1.4 數據處理

本研究均進行3次重復試驗，并使用Origin 9.1、PeakFitv4.12、GraphPad Prism 8軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 小米4種蛋白微觀形態

使用掃描電鏡對小米4種蛋白的微觀形態進行了觀察。圖1a中清蛋白的直徑在200 nm左右，清蛋白顆粒之間呈現不同程度的融合和折疊；圖1b中球蛋白的直徑在100～500 nm之間，蛋白之間形成了簇狀結構，發生了一定程度的拉伸與融合，形狀多樣，有呈塊狀的趨勢；圖1c中醇溶蛋白的直徑在50～500 nm之間，顆粒分明，聚集程度小，但堆積程度高；圖1d中谷蛋白的直徑在200～1 100 nm之間，蛋白大小不一，沒有發生聚集，但都堆積在一起。Gulati等[23]在黍米粉和提取的蛋白質中觀察到球形蛋白體，以簇狀形態存在，與本實驗結果相似。

圖1 小米4種蛋白的微觀形態

2.2 小米4種蛋白的亞基分布

小米4種蛋白的亞基分布如圖2所示。清蛋白的分子質量分布在11～180 ku之間，亞基條帶分布廣，無特征亞基條帶出現；球蛋白的分子質量分布在11～75 ku之間，亞基條帶主要集中在11～19 ku，球蛋白有兩條明顯的特征亞基條帶出現，分子質量分別為18 ku和66 ku；醇溶蛋白的分子質量分布在11～22 ku之間，條帶分布清晰，有三條明顯的特征亞基條帶，其分子質量分別為12、18、22 ku，醇溶蛋白的這三條亞基帶分別名為α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白，這與郭蓮東[24]等的研究相似；谷蛋白的分子質量分布在17～180 ku之間，谷蛋白有4條明顯的特征亞基條帶，其分子質量分別為18、22、95、180 ku。除了球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白具有特征亞基帶外，小米4種蛋白含有一些分子質量相同的亞基帶。

圖2 小米4種蛋白的亞基分布

2.3 小米4種蛋白粒徑分布、平均粒徑和Zeta-電位分析

通過電位分析儀的動態光散射技術測定了4種蛋白懸浮液的粒徑分布、平均粒徑以及Zeta-電位。從圖3可見，懸浮液中的清蛋白粒徑分布在50～950 nm之間，粒徑為295 nm的清蛋白聚集體強度最高；球蛋白粒徑分布在150～600 nm之間，粒徑為220 nm的球蛋白聚集體強度最高；醇溶蛋白粒徑分布在0～300 nm之間，粒徑為24.4 nm和142 nm處的醇溶蛋白聚集體強度較高；谷蛋白粒徑分布在0～600 nm之間，粒徑為164 nm處的谷蛋白聚集體強度最高，4種蛋白中球蛋白分布最緊湊，粒徑強度也更高。

圖3 小米4種蛋白的粒徑分布

平均粒徑可以反映蛋白顆粒群體的平均尺度。從圖4可見，清蛋白聚集體的平均粒徑為215 nm，球蛋白聚集體的平均粒徑為225 nm，醇溶蛋白聚集體的平均粒徑為162 nm，谷蛋白聚集體的平均粒徑為144 nm，4種蛋白中球蛋白的平均粒徑最大。平均粒徑結果表明清蛋白和球蛋白的分子粒徑較大，這可能與清蛋白和球蛋白的簇狀結構有關，聚集程度高，這與掃描電鏡中對其表觀形貌的觀察結果相一致。

圖4 小米4種蛋白的平均粒徑

由于蛋白納米顆粒會帶有電荷，電荷會影響周圍懸浮液的離子分布，顆粒周圍的滑動層為Zeta-電位，所以Zeta-電位的絕對值大小可以反應懸浮液的穩定性[25]。Zeta-電位的絕對值小于30 mV表示懸浮液不穩定，相反Zeta-電位的絕對值大于30 mV表示懸浮液體系穩定。由圖5可見，清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的Zeta-電位分別為-11.63 mV、19.77 mV和-7.94 mV，這三種蛋白Zeta-電位的絕對值都小于30mV，說明三種蛋白懸浮液穩定性差，更容易產生沉淀，谷蛋白的Zeta-電位為-34.97 mV，其絕對值大于30 mV，這表明谷蛋白的懸浮液穩定性很好，保存時間更長。

圖5 小米4種蛋白的Zeta-電位

2.4 小米4種蛋白紅外結構分析

圖6 小米4種蛋白的紅外光譜

從表1中可以看到4種蛋白中都含有α-螺旋、β-折疊、β-轉角、β-反平行折疊和無規則卷曲結構。其中α-螺旋、β-折疊以及β-轉角結構含量較高，β-反平行折疊和無規則卷曲結構含量較低。特別地，與其他三種蛋白相比醇溶蛋白α-螺旋結構的含量明顯較低。

2.5 紫外光譜分析

蛋白中由于含有一些發色基團(羰基、羧基等)，這些發色基團可以吸收部分波長的紫外光而使得蛋白具有紫外吸收光譜，發色基團不同，蛋白的吸收峰位置也不同[27]。從圖7中可以清晰看到4種蛋白分別含有兩個特征吸收峰，清蛋白和球蛋白在210 nm處有特征吸收峰，醇溶蛋白和谷蛋白在225 nm處有特征吸收峰；220 nm附近吸收峰的形成主要是由于蛋白中的肽鍵所引起的，還可以看到球蛋白在260 nm處有較強的特征吸收峰，此吸收峰的形成可能跟苯丙氨酸殘基發光有關，這表明球蛋白內苯丙氨酸在微環境中表達程度較高，清蛋白和谷蛋白在275 nm處有微弱的特征吸收峰，醇溶蛋白在280 nm處有較強的特征吸收峰，280 nm附近吸收峰的形成是由于色氨酸殘基和酪氨酸殘基內的共軛雙鍵引起的，說明這三種蛋白中酪氨酸、色氨酸的表達程度高。

表1 小米4種蛋白二級結構的含量

圖7 小米4種蛋白的紫外光譜

2.6 熒光光譜分析

與紫外光譜相似，酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的氨基酸殘基在紫外光的激發下會發射熒光，因此熒光光譜檢測是對蛋白結構表征的常用手段[28]。當激發波長為280 nm時，蛋白質內表達熒光的氨基酸有色氨酸和賴氨酸，色氨酸的熒光強度更高，因此以檢測色氨酸為主的熒光強度可以反映4種蛋白的三級結構。由圖8可知，在固定激發波長為280 nm的條件下，清蛋白在349 nm處熒光強度最高，球蛋白在348 nm處熒光強度最高，醇溶蛋白在341 nm處熒光強度最高，谷蛋白在342 nm處熒光強度最高。根據熒光強度可以初步判斷，4種蛋白中色氨酸與酪氨酸總量：清蛋白>醇溶蛋白>球蛋白>谷蛋白。

圖8 小米4種蛋白的熒光光譜

2.7 小米4種蛋白的表面疏水性

蛋白質的表面疏水性與其在水中的溶解度有關，溶解度越高，表面疏水性越低[29]。疏水性氨基酸越多，越可以改善水和蛋白質的相互作用，從而達到穩定蛋白質的效用。此外蛋白質的起泡性、起泡穩定性、乳化性以及乳化穩定性都與表面疏水性有關。從圖9可以看出，疏水性：醇溶蛋白>球蛋白>谷蛋白>清蛋白。參考Osbrone分級提取法的原理，清蛋白是由蒸餾水提取出來的，說明清蛋白更能溶于水，結果也顯示清蛋白的疏水性最低，醇溶蛋白由醇類試劑提取，在水中的溶解度不強，所以醇溶蛋白的表面疏水性最高，鹽提的球蛋白和堿提的谷蛋白疏水性介于中間。

圖9 小米4種蛋白的表面疏水性

3 結論

通過SDS-PAGE、掃描電鏡、粒徑、Zeta-電位、FTIR、紫外光譜、熒光光譜、表面疏水性對小米4種蛋白進行結構表征。可以發現微觀狀態下的清蛋白和球蛋白存在簇狀結構，有呈塊狀的趨勢，粒徑分析也表明清球蛋白平均粒徑較大，醇溶蛋白和谷蛋白堆積程度高，但蛋白顆粒分明，不聚集。從電泳圖中觀察到醇溶蛋白亞基分子質量低(11～25 ku)，亞基帶分布明顯清晰，而小分子蛋白更容易被人體消化吸收，清蛋白、球蛋白、谷蛋白亞基帶分布廣泛。醇溶蛋白Zeta-電位最低，在介質中最不穩定，更容易產生沉淀，谷蛋白的Zeta-電位絕對值超過30 mV，說明其在介質中最穩定，保存時間更長。二級結構可發現4種蛋白中各個結構都有占比，在有序結構中，清蛋白的α-螺旋和β-折疊所占比例最高(55.18%)，其次是谷蛋白(54.80%)和球蛋白(52.93%)，而醇溶蛋白的有序結構占比最低(43.75%)。紫外光譜和熒光光譜顯示4種蛋白在紫外光的照射下均出現不同波長特征吸收峰，這與其內含氨基酸殘基有關。清蛋白表面疏水性最低，溶解性更好，醇溶蛋白與之相反，而溶解性又與蛋白質的功能性質如起泡性、起泡穩定性等有關，因而，醇溶蛋白的功能性質較差，不利于加工，利用率低，之后研究可利用一些方法對醇溶蛋白進行改性，從而改善其功能性質。