總評歸一法結合響應面法優化補腎強筋丸提取工藝△

崔旭輝，尚佳，李喜香*，陳國華，周婷婷，劉永昌

1.甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫院 藥學部，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730000

補腎強筋丸是清代醫家錢壽昌經驗方——補腎壯筋湯隨癥加減而成，目前臨床主要用于治療骨質疏松型氟骨癥[1-2]，療效較好。研究表明，氟骨癥已經長時間困擾全球大部分貧困地區的居民[3]，而中醫認為，此類病癥屬于“骨痹”和“筋痹”范疇[4]。故全方由熟地黃、山茱萸、當歸等10 味中藥組成，其中熟地黃、山茱萸補益肝腎、益精填髓；杜仲、續斷、五加皮強筋健骨、療傷續折；當歸、白芍、川牛膝補血活血、柔肝止痛；茯苓、青皮行氣健脾，諸藥合用，共奏補腎強筋功效。

目前，補腎壯筋方以湯劑入藥，但湯劑作為傳統劑型存在煎煮繁瑣、攜帶困難、口感不佳等缺點，故本課題組擬將其開發為穩定性高、服藥和攜帶方便的濃縮丸劑。經過前期相關文獻調研發現，方中君藥熟地黃中的指標成分毛蕊花糖苷已經改為地黃苷D，并且測定地黃苷D 成分含量的文獻較少，在當前中藥復方成分含量測定成為熱點的前提下，多指標、多成分的測定已成為共識[5-7]。故本研究將地黃苷D、馬錢苷、莫諾苷、阿魏酸的含量及浸膏得率一同作為考察指標，最后采用多指標總評歸一法結合響應面法對補腎強筋丸提取工藝的參數進行優化，得到最佳提取工藝參數，以期為該濃縮丸劑提取工藝的優化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY ARC 型高效液相色譜儀，配置四元溶劑管理器、FTN-R 型樣品管理器、2998 型二極管陣列檢測器（美國Waters 公司）；KQ-300DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；98-1-BN 型電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；HH-6型數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；SECURA125-1CN 型十萬分之一天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；Elix Essential 5 型純水機（德國默克公司）；RE3000B 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；ZXFD-A5140 型鼓風干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

對照品地黃苷D（批號：L16J11Y118585，純度：98%）、馬錢苷（批號：P22F10F81444，純度：98%）、莫諾苷（批號：P11M11F112846，純度：97%）、阿魏酸（批號：L03A9D57744，純度：98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純（德國默克公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

藥材熟地黃（批號：191214）、山萸肉（批號：200803）、當歸（批號：190812）、杜仲（批號：190501）、川牛膝（批號：200101）、茯苓（批號：200704）、白芍（批號：191109）、續斷（批號：200404）、青皮（批號：191210）、五加皮（批號：20200701）均購自甘肅康樂藥業有限責任公司，經甘肅省中醫院李喜香主任中藥師鑒定為正品，均符合《中華人民共和國藥典》2020 年版（一部）項下有關規定。

2 方法與結果

2.1 提取液的制備

按處方稱取藥材55 g于圓底燒瓶中，加水550 mL，浸泡30 min，加熱回流60 min，提取2 次，4 層紗布濾過，得水提液，減壓濃縮并定容至55 mL，即得。

2.2 莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸的含量測定

2.2.1 色譜條件 Waters Sun Fire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，5%～6%A；7～8 min，6%～10%A；8～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%～20%A；30～36 min，20%～25%A；36～39 min，25%～5%A；39～44 min，5%A）；體積流量：1.0 mL·min–1；進樣量：10 μL；柱溫：28 ℃；檢測波長：252 nm。

2.2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸對照品適量于5 mL 量瓶中，加甲醇制成質量濃度分別為1.121、1.042、0.560 mg·mL–1的莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸對照品儲備液，精密吸取適量，置于同一5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸質量濃度分別為0.448、0.416、0.031 mg·mL–1的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密量取2.1 項下提取液5 mL 于蒸發皿中，水浴蒸干。加甲醇溶解，定容至25 mL，超聲40 min。混勻后用0.2 μm 的微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按照處方工藝分別制得缺山茱萸、當歸的陰性樣品，按2.1及2.2.3項下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗 取混合對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，按2.2.1 項下條件進樣測定，結果見圖1。由圖1可知，各成分均能達到基線分離（分離度>1.5），陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 補腎強筋丸中莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸的HPLC圖

2.2.6 線性關系考察 分別精密量取混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容，制成質量濃度分別為4.48、8.96、22.40、35.84、44.80 μg·mL–1的莫諾苷對照品溶液，4.16、8.32、20.80、33.28、41.60 μg·mL–1的馬錢苷對照品溶液，0.31、0.62、1.54、2.46、3.10 μg·mL–1的阿魏酸對照品溶液，分別精密吸取10 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1。

表1 補腎強筋丸中莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸線性關系

2.2.7 精密度試驗 取混合對照品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定6 次，測得莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸峰面積RSD 分別為2.12%、2.65%、1.37%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于2、4、6、8、12、24 h 按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，測得莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸峰面積RSD 分別為2.01%、2.85%、1.92%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.9 重復性試驗 取同一提取液，按2.2.3 項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，測得莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸含量RSD 分別為1.91%、2.44%、1.37%，表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密吸取3 個成分含量已知的供試品溶液1.0 mL，共9 份，每3 份為一組，分別按低（80%）、中（100%）、高（120%）3 個水平精密加入2.2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.2.3 項下方法制成供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表2。

表2 補腎強筋丸中莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸加樣回收率試驗結果

2.3 地黃苷D含量測定

2.3.1 色譜條件 Waters Sun Fire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1%磷酸水溶液（5∶95）；體積流量：1.0 mL·min–1；進樣量：10 μL；柱溫：28 ℃；檢測波長：203 nm。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取地黃苷D 對照品適量于5 mL 量瓶中，加甲醇制成質量濃度為0.925 mg·mL–1的地黃苷D 對照品儲備液，精密吸取適量，置于同一5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得質量濃度為0.183 mg·mL–1的地黃苷D 對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 精密量取2.1 項下提取液5 mL 于蒸發皿中，水浴蒸干。加甲醇溶解，定容至25 mL，超聲40 min。混勻后用0.2 μm 的微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.3.4 陰性樣品溶液制備 按處方工藝，制得缺熟地黃的陰性樣品，按2.1 及2.3.3 項下方法制備，即得。

2.3.5 專屬性試驗 取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液適量，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，結果見圖2。由圖2可知，各成分均能達到基線分離（分離度>1.5），表明該方法專屬性良好。

圖2 補腎強筋丸中地黃苷D的HPLC圖

2.3.6 線性關系考察 精密量取地黃苷D 對照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容，制成質量濃度分別為1.83、3.66、9.15、14.46、18.30 μg·mL–1的地黃苷D 對照品溶液，精密吸取10 μL，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，Y=10 191X–3 277.5（r=0.999 7），在1.83～18.30 μg·mL–1線性關系良好。

2.3.7 精密度試驗 取對照品溶液適量，按2.3.1項下色譜條件進樣測定6 次，測得地黃苷D 峰面積RSD為2.51%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于2、4、6、8、12、24 h 按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，測得地黃苷D 峰面積RSD 為2.29%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.9 重復性試驗 取同一份提取液，按2.3.3 項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，測得地黃苷D 含量RSD 為2.66%，表明該方法重復性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗 精密吸取地黃苷D 含量已知的供試品溶液1.0 mL，共9 份，每3 份為一組，分別按低（80%）、中（100%）、高（120%）3 個水平精密加入2.3.2項下對照品溶液適量，按2.3.3項下方法制成供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進行測定，測得地黃苷D 平均加樣回收率為100.21%，RSD為1.86%。

2.4 浸膏得率的測定

準確吸取2.1 項下提取液5 mL，置已干燥至質量恒定的蒸發皿中，水浴蒸干后，烘箱中105 ℃干燥3 h，移至干燥器中冷卻至室溫，迅速精密稱定質量，按公式（1）計算干浸膏提取率[8]。

2.5 工藝優化

2.5.1 單因素試驗 通過前期查閱相關文獻可知，對于大多數苷類成分來說，水提比醇提效果更好[9]，結合本劑型通常不采用醇提[10]，故本研究采用水提。篩選提取次數、浸泡時間、提取時間、溶劑量，按2.1 項下方法制備提取液，進行考察，結果見圖3。由圖3 可知，提取數為1～2 次時4 個成分提取量增長較為急劇，而2～3次時較緩，甚至下降，并且提取次數為非連續變量，無法進行回歸處理，故將其固定為2次；浸泡時間為45 min時4個成分提取量最高，故選擇30～60 min進行考察；提取時間為30～60 min時4個成分提取量增加較緩，60～90 min時增加較快，隨后又逐漸下降減緩，故選擇60～120 min 進行考察；溶劑量為10 倍時4 個成分提取量達到最高并逐漸變緩，故選擇8～12倍水進行考察。

圖3 補腎強筋丸提取工藝單因素試驗結果

2.5.2 中心組合設計-響應面法 在單因素試驗結果基礎上，將浸泡時間（A）、提取時間（B）、溶劑量（C）作為考察因素[11-12]，以地黃苷D、馬錢苷、莫諾苷、阿魏酸含量和浸膏得率的總評歸一值（OD值）作為響應值進行綜合評分，通過Hassan 法[13]對各指標進行歸一化處理，由于本研究要求各指標成分含量越大越好，故選擇公式（2）計算各指標OD值。

其中，di為各指標的OD 值，Yi為指標測定值，Ymax、Ymin分別為各指標在20 次實驗中的最大值、最小值；OD=（d1d2……dn）1/n，其中n為所選取的指標數。設計三因素五水平試驗，因素水平見表3。

按處方比例稱取藥材共55 g，按表3 參數加熱回流提取2次，減壓濃縮至55 mL，測定提取液中各指標成分含量及浸膏得率，計算OD 值，結果見表4。

表3 補腎強筋丸提取工藝響應面試驗因素水平

運用Design Expert 8.0.6軟件對表4數據分別進行多元線性、二項式回歸擬合分析，分別得到A、B、C 與OD 值之間的回歸模擬方程：OD=–0.858 28+0.006 02A+0.006 83B+0.036 31C（r=0.541 4）、OD=1.129 68+0.016 98A–0.015 84B–0.238 69C–0.000 07AB–0.000 62AC–0.000 59BC+0.000 02A2+0.000 18B2+0.017 80C2（r=0.852 7），結果表明二項式回歸模型擬合度更好，可用于優化工藝。方差分析見表5。

表4 補腎強筋丸提取工藝響應面試驗設計及結果

由表5 可知，模型F=6.43，P<0.01，表明模型具有極顯著影響；F失擬＝0.26，P=0.914 6>0.05，表明模型失擬項不顯著，可以用此模型進行分析和預測；因素B、B2差異有統計學意義（P<0.01），因素A 差異有統計學意義（P<0.05），而交互項均不顯著；各因素的影響程度依次為B>A>C。

表5 補腎強筋丸提取工藝響應面方差分析結果

利用Design Expert 8.0.6 軟件得到二次回歸方程等高線及響應曲面圖，從而確定最佳提取工藝參數，結果見圖4～6。由圖4～6 可知，B 的等高線密度均大于A和C，說明提取時間對成分提取量的影響最大，與方差分析結果一致，且指標成分隨著3個因素的增加而有增加的趨勢；最終確定最佳提取工藝為12倍水，浸泡60 min，提取120 min，提取2次。

圖4 浸泡時間與溶劑量對OD值影響的響應面圖

再按上述最佳工藝進行3批驗證，測得OD 值分別為0.723 7、0.702 9、0.743 3，平均為0.723 3，RSD 為2.79%，同時與預測值0.745 7 相比偏差為3.0%，表明工藝穩定可行、重復性良好。結果見表6。

表6 補腎強筋丸提取工藝驗證實驗結果

3 討論

補腎強筋方原劑型為湯劑，但因攜帶不便、患者依從性較差，故改為濃縮丸劑。全方以熟地黃、山茱萸為君藥，當歸、杜仲為臣藥，續斷、五加皮、白芍、茯苓、青皮為佐藥，川牛膝為使藥。其中，熟地黃的指標成分為地黃苷D[5]，現代藥理研究表明，其具有提高免疫力、抗骨質疏松、抗炎等藥理作用[14]；山茱萸活性成分為馬錢苷和莫諾苷[5]，具有抑制軟骨細胞凋亡、促進細胞生長、延緩骨關節炎等藥理作用[15-16]；當歸的活性成分為阿魏酸[5]，具有抗炎、鎮痛、抗成骨細胞凋亡等藥理作用[17]。這4個成分的藥理作用與補腎強筋丸發揮補益肝腎、強筋健骨藥效作用有關，同時充分考慮了處方君臣佐使的組方原則、藥物各自的化學性質。臣藥杜仲中的指標成分松脂醇二葡萄糖苷[5]在本研究中含量較低，可能與其膠絲有關[18]，為了減小誤差，本研究未將松脂醇二葡萄糖苷作為指標成分。因此，本研究將地黃苷D、馬錢苷、莫諾苷、阿魏酸作為指標成分。另外，浸膏得率也常作為中藥復方提取工藝的評價指標[19]，故也將其納入研究。

圖5 浸泡時間與提取時間對OD值影響的響應面圖

圖6 提取時間與溶劑量對OD值影響的響應面圖

本研究采用190～400 nm 全波長掃描，經查閱文獻，4個成分的吸收波長差異較大[5]，本課題組在多次驗證后發現，252 nm時各峰的吸收明顯好于237 nm，且分離度良好，故最終確定203、252 nm 檢測。在流動相方面，本研究考察了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水，發現后者峰形更好，各成分分離效果更佳，最后綜合考慮將后者作為流動相。

在權重系數的選擇上，由于多指標評價采用打分制時存在一定主觀性，故本研究對其進行歸一化處理，以地黃苷D、馬錢苷、莫諾苷、阿魏酸含量和浸膏得率的總評OD 值為評價指標，通過星點設計-效應面法來優化補腎強筋丸的提取工藝。結果表明，補腎強筋丸最佳提取工藝為12 倍水提取2次，每次浸泡60 min，提取120 min，所得OD 值與預測值相當，表明該方法提取效率較高、重復性較好、工藝穩定可行。