Box-Behnken優化紅景天中紅景天苷和酪醇的提取工藝△

李杰，左想想，張南茜，劉江齊，朱艷平，劉耀

1.河南科技大學 基礎醫學院，河南 洛陽 471023；2.南召縣林業局，河南 南陽 474650

紅景天為景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola roseaL.）多年草本或亞灌木野生植物，主要以莖和根入藥。其性平，味甘、微苦，具有益氣活血、通脈平喘的功效，常用于氣虛血瘀、胸痹心痛、卒中偏癱等[1]。近代研究表明，紅景天苷和酪醇是紅景天的主要活性組分，具有保護神經細胞、增強機體免疫力、抑制癌細胞生長、防止肝纖維化等藥理作用[2-4]，被廣泛應用于醫藥、化工、保健、食品等領域。目前常用甲醇或乙醇提取紅景天苷和酪醇，甲醇或乙醇為提取溶劑存在著易燃、易爆、易揮發、溶劑殘留等問題。因此需要一種綠色高效的提取溶劑來提取紅景天苷和酪醇。

低共熔溶劑（DESs）是由Abbott 等[5]合成的一種新型綠色溶劑，主要由氫鍵受體和氫鍵給體兩類化合物組成，具有廉價易得、難揮發、無毒、可生物降解等優點，是傳統溶劑的良好替代品[6-7]。吳蓉等[8]以乙酰丙酸-乙二醇（1∶1）組成的DESs提取紅景天苷和酪醇，結果表明，在攪拌速率為150 r·min–1，料液比為1.0∶2.5，提取溫度為60 ℃，提取時間為65 min 時，紅景天苷和酪醇的提取率最佳，分別是同等條件下水和乙醇提取率的1.2、1.1 倍。但其提取時間長，同時以價格昂貴的乙酰丙酸為氫鍵受體，提取成本高，因此有必要對該提取方法進行改進和完善。氯化膽堿是一種應用廣泛的氫鍵受體，具有廉價易得、綠色環保等優點。Ali 等[9]以氯化膽堿為氫鍵受體，蘋果酸、草酸、對甲基苯磺酸等為氫鍵給體制備了11 種DESs，提取枸杞中的黃酮類化合物。結果表明，氯化膽堿-對甲基苯磺酸（1∶2）組成的DESs提取效果最佳。Zhou等[10]制備了以氯化膽堿、甜菜堿及L-脯氨酸為氫鍵受體的12 種DESs，用以提取桑葉中的酚酸類化合物。結果顯示，氯化膽堿為氫鍵受體，檸檬酸為氫鍵給體組成的DESs提取效果最佳，遠優于傳統的甲醇提取和水提取。Zhang等[11]以氯化膽堿為氫鍵受體，草酸等為氫鍵給體制備了6種DESs，提取茯苓多糖。發現氯化膽堿-草酸（1∶2）組成的DESs，多糖提取率是傳統熱水提取率的8.6 倍。因此，本研究以氯化膽堿為氫鍵受體，丙三醇等為氫鍵給體，制備了一系列的DESs，并在超聲輔助的條件下提取紅景天中的紅景天苷和酪醇，同時運用Box-Behnken 響應面法對該提取工藝進行優化，以期為紅景天中紅景天苷和酪醇的快速高效提取提供一種新思路，同時為后期的紅景天苷和酪醇的性能研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BT125D 型雙量程電子分析天平（德國多利斯公司）；CT14RD 型高速冷凍離心機、LC2000 型高效液相色譜儀（上海天美科學儀器有限公司）；KQ2200DE 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-420型磁力攪拌恒溫水浴鍋（上海力辰儀器科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品酪醇（批號：H23M10Z89089，純度≥98%）、紅景天苷（批號：C13J8Q39713，純度≥98%）、氯化膽堿（分析純）均購自上海源葉生物科技有限公司；尿素、丙三醇、乙二醇、1,2-丙二醇、丙二酸（天津科密歐化學試劑有限公司）均為分析純；甲醇（天津巴斯夫分析試劑有限公司，色譜純）。

紅景天飲片（批號：20200801174）購于洛陽市，經河南科技大學基礎醫學院歐麗娜副教授鑒定為景天科薔薇紅景天Rhodiola roseaL.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Kromasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2% 磷酸水（18∶82）；流速：0.8 mL·min–1；進樣量：20 μL；檢測波長：276 nm；柱溫為室溫。

2.2 標準曲線的制備

精密稱取紅景天苷對照品12.0 mg和酪醇對照品10.0 mg 于燒杯內，甲醇溶解后，分別定容于10 mL棕色量瓶內。然后分別移取紅景天苷對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL和酪醇對照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，混合于10 mL棕色量瓶中。最后移取上述混合對照品溶液2.5 mL于5 mL量瓶中，18%甲醇定容，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得紅景天苷和酪醇的混合對照品溶液。按2.1項下色譜條件檢測，以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線。紅景天苷：Y=7 178.3X–26 588（r=0.999 6）；酪醇：Y=17 606X–29 055（r=0.999 7）。紅景天苷在24～120 μg·mL–1線性關系良好；酪醇在15.0～75.5 μg·mL–1線性關系良好。

2.3 DESs的制備

將氯化膽堿分別與丙三醇、尿素、乙二醇、1,2-丙二醇、丙二酸按表1 的摩爾比混合于具塞錐形瓶內，在80 ℃水浴條件下攪拌至完全溶解，取出冷卻至室溫，備用。

表1 DESs種類及摩爾比

2.4 供試品溶液的制備

稱取紅景天粉末1.0 g于具塞錐形瓶中，按照一定的液料比加入不同含水量的DESs，室溫條件下超聲（200 W，20 kHz）提取一定時間后，移取提取液2 mL，10 000 r·min–1離心5 min（離心半徑為6.36 cm），取上清液1 mL于5 mL量瓶中，18%甲醇定容，0.45 μm微孔過濾器濾過，按2.1 項下色譜條件檢測紅景天苷和酪醇的含量。

2.5 響應面優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以紅景天苷和酪醇的提取率為評價指標，采用Box-Behnken 響應面法對超聲輔助DESs提取紅景天中紅景天苷和酪醇的影響因素進行優化，因素水平見表2。

表2 紅景天中紅景天苷和酪醇提取工藝Box-Behnken響應面試驗設計因素與水平

2.6 紅景天苷和酪醇提取率的計算

根據樣品的紅景天苷和酪醇的平均峰面積和標準曲線，按公式（1）和（2）計算紅景天苷和酪醇的提取率（Y）。

式中，N為提取液的稀釋倍數，V為提取液總體積，M為紅景天的質量，A1為紅景天苷平均峰面積，A2為酪醇平均峰面積。

2.7 DESs組成的確立

將上述制備的5 種DESs 與水（4∶1），按照液料比為20∶1 加入紅景天藥材粉末，在室溫條件下提取20 min（圖1）。由圖1 可知，紅景天苷和酪醇的提取率與DESs 的組成有關，其中以尿素作為氫鍵給體的DESs 提取率最低；丙三醇與氯化膽堿組成的DESs 提取率最高。因此，本研究將以丙三醇和氯化膽堿組成的DESs 為提取溶劑，進一步探討超聲輔助提取的最佳工藝條件。

圖1 DESs種類對提取率的影響

2.8 單因素試驗

2.8.1 提取時間對紅景天苷和酪醇提取率的影響在含水量為20%，液料比為20∶1 的條件下，研究提取時間對紅景天苷和酪醇提取率的影響，結果見圖2。由圖2可知，隨著提取時間的延長，紅景天苷和酪醇的提取率呈先升高后降低的趨勢，在提取時間為30 min 時，紅景天苷和酪醇的提取率最高。這可能是由于提取時間的延長，提高了植物細胞壁的破碎程度，有利于紅景天苷和酪醇的溶出，但提取時間過長導致紅景天苷和酪醇結構被破壞，提取率降低[12]。因此，提取時間30 min較為合適。

圖2 提取時間對提取率的影響

2.8.2 含水量對紅景天苷和酪醇提取率的影響 在提取時間為30 min，液料比為20∶1的條件下，研究含水量對紅景天苷和酪醇提取率的影響，結果見圖3。由圖3 可知，隨著含水量的增加，紅景天苷和酪醇的提取率先升高后降低。當含水量為30%時，紅景天苷和酪醇的提取率最高。這是由于含水量的升高，降低了DESs 的黏度，黏度的降低有利于提高DESs的傳質效率[13]，提高紅景天苷和酪醇在溶劑的擴散系數。同時，含水量的升高提高了DESs的極性。紅景天苷和酪醇的極性較大，根據相似相溶原理，極性增大有利于紅景天苷和酪醇的溶解。當含水量超過30%后，紅景天苷和酪醇的提取率開始逐漸降低。這可能是由于含水量的增加導致DESs分子間的氫鍵斷裂，超分子結構消失，使得紅景天苷和酪醇的提取率逐漸降低[14-15]。

圖3 含水量對提取率的影響

2.8.3 液料比對紅景天苷和酪醇提取率的影響 在提取時間30 min，含水量為30%的條件下，研究液料比對紅景天苷和酪醇提取率的影響，結果見圖4。由圖4 可知，隨著液料比的增加，紅景天苷和酪醇的提取率先增大后逐漸降低。這可能是由于液料比的升高使物料與溶劑接觸更加充分，促進了紅景天苷和酪醇的溶出，因此提取率升高。但當液料比超過40∶1 時，過多的提取溶劑削弱了超聲波的能量，使超聲波不能有效地破壞植物細胞壁[16-17]，導致紅景天苷和酪醇的溶出量減少，提取率降低。

圖4 液料比對提取率的影響

2.9 Box-Behnken響應面法優化

2.9.1 Box-Behnken 試驗結果與方差分析 根據Box-Behnken 設計原理，以提取時間（A）、含水量（B）和液料比（C）為自變量，以紅景天苷提取率（Y1）為主，酪醇提取率（Y2）為輔，進行三因素三水平的響應面試驗設計。結果見表3。

表3 紅景天中紅景天苷和酪醇提取工藝Box-Behnken試驗設計和結果

利用Design Expert 8.0.6軟件對表3中的試驗結果進行回歸擬合分析，得到二次回歸方程：Y1=–3.54+0.0301A+0.240B+0.406C+0.00268AB–0.00168AC–0.000 450BC–0.005 18A2–0.005 81B2–0.004 56C2；Y2=–3.19+0.0338A+0.191B+0.930C–0.000475AB+0.00180AC+0.00153BC–0.000125A2–0.00392B2–0.00260C2。

由表4 可知，回歸方程的一次項和二次項極顯著，說明各因素對響應值不是簡單的一次線性關系。該模型的P<0.000 1，表明建立的數學模型具有極顯著性，回歸方程能很好地模擬真實曲面，方法可靠；失擬項P=0.556 4>0.05 不顯著，說明該數學模型的擬合度較好[18]。模型中一次項B、C，二次項A2、B2和C2對紅景天苷提取率的影響極顯著（P<0.001），交互項AB 紅景天苷提取率的影響非常顯著（P<0.01），交互項AC 紅景天苷提取率的影響顯著（P<0.05），模型復合相關系數（R2）=0.986 7、校正決定系數（R2Adj）=0.969 6，表明可用該數學模型和二次回歸方程來分析和預測紅景天苷的提取率[19]。由各因素的F值可知B>C>A，說明含水量對紅景天苷提取率的影響最大，其次為液料比，提取時間影響最小。由表5 的酪醇方差分析結果可知，建立的數學模型P=0.001 2<0.01，失擬項P=0.062 5>0.05 表明建立的數學模型達到非常顯著水平。一次項A、C和二次項C2酪醇提取率的影響非常顯著；交互項AC、BC 酪醇提取率的影響顯著。酪醇數學模型的R2和R2Adj分別為0.945 2、0.874 8。由各因素的F值可知，提取時間對酪醇的提取率影響最大，其次為液料比，含水量影響最小。

表4 紅景天苷提取率方差分析結果

表5 酪醇提取率方差分析結果

2.9.2 響應曲面擬合及最優條件確立 利用Design Expert 8.0.6 軟件得到紅景天苷和酪醇的響應面圖（圖5）。由圖5 可知，紅景天苷和酪醇的響應面均為開口向下的凸形曲面，說明在選定的區域內，紅景天苷和酪醇的提取率存在極大值。從圖5中可直觀地看出，含水量的曲面最為陡峭，對紅景天苷提取率的影響最大[20]，其次為液料比和提取時間，與方差分析結果吻合。響應面在底面上的投影為等高線圖，等高線圖的形狀反映了兩因素交互作用對提取率的影響，圓形代表不顯著，橢圓代表影響顯著[21]。由圖5中的等高線圖可知，提取時間和含水量的等高線圖呈橢圓形，因此對紅景天苷的提取率的影響最為顯著。同理，由圖5 可知，提取時間對酪醇提取率影響最大，提取時間和液料比交互作用對酪醇提取率的影響最顯著。經Design Expert 8.0.6 軟件優選的紅景天苷最佳提取條件為提取時間29.64 min，含水量26.07%，液料比37.86∶1.00，理論提取率為11.74 mg·g–1。酪醇的最佳提取條件為提取時間36.26 min，含水量29.77%，液料比39.24∶1.00，理論提取率為2.08 mg·g–1。

圖5 提取時間、含水量及液料比對紅景天中紅景天苷和酪醇提取率影響的響應面和等高線圖

2.9.3 驗證實驗 由于紅景天苷是紅景天的特征組分且含量較高，因此對優化得到的紅景天苷提取條件進行了驗證。為了方便操作將紅景天苷提取的最佳條件修正為提取時間30 min，含水量26%，液料比38∶1，進行3 次平行實驗。結果表明，在此條件下紅景天苷和酪醇的平均提取率分別為11.64、2.02 mg·g–1，與預測值基本相符。說明基于Box-Behnken 響應面法建立的回歸方程和數學模型穩定可靠，優選的工藝參數準確可靠，具有一定的實際參考價值。

3 結論

近年來，應用超聲輔助技術提取中藥材中活性組分受到了研究者的廣泛關注[22-23]。超聲輔助提取主要是利用超聲波產生的空化效應、機械效應以及熱效應，提高物質分子的運動頻率和速度，促進細胞壁的破裂，從而使細胞內容物快速溶出，達到快速、高效提取的目的。因此，與傳統的熱回流提取、煎煮提取等方法相比，超聲輔助提取可有效保障活性組分從中藥材中快速溶出，同時避免了長時間加熱而導致失活。本研究以氯化膽堿為氫鍵受體，尿素、乙二醇、丙二酸、1,2-丙二醇、甘油為氫鍵給體，制備了5 種綠色環保的DESs。通過對比發現，在超聲輔助下氯化膽堿-丙三醇組成的DESs 提取紅景天苷和酪醇效果最佳。在此基礎上，采用設計方法簡單、可信度較高的Box-Behnken 設計對超聲輔助DESs 提取工藝進行了優化，建立了紅景天苷和酪醇與提取時間、含水量及液料比之間的多元數學統計模型。確立了紅景天苷和酪醇提取的最佳工藝參數，即提取時間30 min，含水量26%，液料比38∶1，在此條件下紅景天苷和酪醇的提取率分別為11.64、2.02 mg·g–1，與數學模型預測值基本相符，表明建立的數學模型穩定、可靠，得到的最佳提取工藝條件具有一定的實際應用價值，可為紅景天苷和酪醇的快速高效提取提供參考，同時可為紅景天的質量控制和綜合開發利用提供借鑒。